markdown:
# Chương 6: Công nghệ protein
Chia sẻ: Hà Ngọc Sơn | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:55
lượt xem 413
download
![](https://tailieu.vn/image/document/thumbnail/2010/20100110/thangkhobietchat2001/80x100/161569_048.jpg)
##
Chương 6: Công nghệ protein
[Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ](javascript:void(0);)
Download
![](https://tailieu.vn/static/b2013az/templates/version1/default/images/down16x21.png)
Công nghệ protein là một hướng nghiên cứu quan trọng của công nghệ sinh học, có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Trên cơ sở công nghệ DNA tái tổ hợp hiện nay nhiều loại protein nguyên thể (protein thế hệ thứ nhất), protein đã được sửa đổi hoặc mới (protein thế hệ thứ hai) đang được sản xuất nhờ các sinh vật prokaryote như vi khuẩn E. coli hoặc eukaryote như nấm men Sac. cerevisiae. Do tốc độ sinh sản nhanh nên vi sinh vật có thể sản xuất các protein với số lượng lớn trong một thời gian...
Bình luận(0)
[Đăng nhập để gửi bình luận!](javascript:void(0);)
##
Nội dung Text: Chương 6: Công nghệ protein
- Chương 6 Công nghệ protein I. Mở đầu Công nghệ protein là một hướng nghiên cứu quan trọng của công nghệ sinh học, có tiềm năng ứng dụng rất lớn. Trên cơ sở công nghệ DNA tái tổ hợp hiện nay nhiều loại protein nguyên thể (protein thế hệ thứ nhất), protein đã được sửa đổi hoặc mới (protein thế hệ thứ hai) đang được sản xuất nhờ các sinh vật prokaryote như vi khuẩn E. coli hoặc eukaryote như nấm men Sac. cerevisiae. Do tốc độ sinh sản nhanh nên vi sinh vật có thể sản xuất các protein với số lượng lớn trong một thời gian ngắn, sản phẩm được tinh sạch không có nguy cơ nhiễm bẩn virus như các trường hợp được tách chiết từ người. Đối với một số protein có cấu trúc phức tạp không thể biểu hiện ở vi khuẩn hoặc biểu hiện với hiệu suất thấp ở nấm men, người ta đang có xu hướng chuyển gen mã hóa của nó vào thực vật. Lý do là vì hệ thống thực vật có nhiều ưu điểm như có thể trồng trên quy mô lớn nhờ năng lượng mặt trời nên ít tốn kém hơn, các virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh cho người, các gen biểu hiện ở mô tạo dầu thực vật nên rất dễ tách chiết và thu nhận protein. Công nghệ protein là quá trình xây dựng các phân tử protein mới, bằng cách thiết kế một phân tử protein dựa trên các nguyên lý cơ bản nhất, hoặc sửa đổi cấu trúc của một protein đang có, nhằm mục đích: - Nghiên cứu quá trình lắp ráp của các protein và các nhân tố của chuỗi sơ cấp tham gia vào sự cuộn xoắn, ổn định và thể hiện chức năng của chúng. Các đặc điểm này có thể được khảo sát bằng cách sửa đổi một hoặc nhiều amino acid đặc trưng theo một kiểu đã được định hướng trong protein và quan sát kết quả sau khi sản xuất phiên bản đã được sửa đổi. Thông thường các protein có trình tự tương tự không giống nhau hoàn toàn, tồn tại trong tự nhiên sẽ có các tính chất hơi khác nhau và người ta có thể dựa vào các trình tự khác nhau này để tiến hành những sửa đổi sau đó. - Sản xuất các phân tử protein ổn định cho một mục đích công nghệ đặc biệt, tuy nhiên các phiên bản được tìm thấy trong tự nhiên không có các tính chất tối ưu cần thiết. Ví dụ: một enzyme có thể được xem như một phần Nhập môn Công nghệ sinh học 182
- của một quá trình công nghiệp nhưng một điểm đặc trưng của enzyme, chẳng hạn độ ổn định nhiệt hoặc là độ pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác… không thể tương thích với quá trình đó. Các thay đổi amino acid có thể biến đổi enzyme này sao cho nó thực hiện chức năng tốt hơn trong môi trường mới. Có nhiều minh họa khác nhau về protein được sửa đổi để giúp cho chúng phù hợp tốt hơn với các hoạt động công nghệ và thương mại, và một số trong đó được trình bày ở mục IV-Một số ứng dụng của công nghệ protein. Muốn công nghệ hóa một protein cần phải hiểu biết về các nguyên lý cấu trúc của protein đó và đặc điểm của nguyên liệu để thiết kế hợp lý, hoặc sửa đổi các tính chất mong muốn. Hơn nữa, công nghệ này phải có được các công cụ sản xuất và phân tích protein mong muốn. Các công cụ và nguyên lý cơ bản hiện nay đang được phát triển song song. Các phần dưới đây cung cấp những kiến thức cơ bản của công nghệ protein và tóm tắt một vài phát triển của lĩnh vực này trong thời gian gần đây. II. Cấu trúc protein Các nghiên cứu về cấu trúc của protein đã cho thấy có thể phân biệt cấu trúc của phân tử protein thành bốn bậc như sau: Cấu trúc bậc một (cấu trúc sơ cấp) là trình tự sắp xếp các amino acid trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ các liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị). Cấu trúc bậc hai (cấu trúc thứ cấp) là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở gần nhau trong chuỗi polypeptide, hay nói cách khác đó là dạng cuộn xoắn cục bộ (local fold) của từng phần trong chuỗi polypeptide. Cấu trúc này được giữ vững nhờ liên kết hydrogen được tạo thành giữa các liên kết peptide ở gần kề nhau, cách nhau những khoảng xác định. Cấu trúc bậc ba là tương tác không gian giữa các gốc amino acid ở xa nhau trong chuỗi polypeptide, là dạng cuộn xoắn trong không gian của toàn chuỗi polypeptide (overall fold), đây là hình dạng chung của chuỗi polypeptide. Các liên kết như liên kết Van der Waals, liên kết tĩnh điện, liên kết hydrogen giữa các mạch bên của các gốc amino acid đều tham gia giữ vững cấu trúc bậc ba. Cấu trúc bậc bốn xuất hiện ở những phân tử protein bao gồm hai hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu (bậc ba), tương tác không gian (sự sắp xếp) giữa các chuỗi này trong phân tử gọi là cấu trúc bậc bốn. Mỗi chuỗi polypeptide Nhập môn Công nghệ sinh học 183
- này được gọi là một tiểu đơn vị (subunit). Chúng gắn với nhau nhờ các liên kết hydrogen, lực Van der Waals giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các tiểu đơn vị (Hình 6.1). Tuy nhiên, đến nay nhiều vấn đề cơ bản về các tính chất của protein vẫn chưa được giải quyết, ví dụ cơ chế cuộn xoắn protein vẫn còn là chủ đề của một số cuộc tranh luận. Phần tiếp theo dưới đây sẽ mô tả các công cụ cơ bản của công nghệ protein và một loạt các ví dụ thành công trong lĩnh vực này. Cấu trúc bậc 1 Cấu trúc bậc 2 Cấu trúc bậc 3 Cấu trúc bậc 4 (cấu trúc sơ cấp) (cấu trúc thứ cấp) Lys Lys Gly Gly Leu Val Ala His Các gốc amino acid Xoắn α Chuỗi polypeptide Các tiểu đơn vị được lắp ráp Hình 6.1. Các bậc cấu trúc của một phân tử protein III. Các công cụ 1. Nhận dạng trình tự Hiện nay, nhận dạng trình tự (sequence identification), bằng phân tích trình tự gen hoặc protein là một quá trình tương đối không khó khăn. Các cơ sở dữ liệu lớn hiện có chứa nhiều ngàn trình tự khác nhau. Hơn nữa, các dự án phân tích trình tự genome đang cung cấp các trình tự mới và các khung đọc mở (open reading frame) với một tốc độ tăng lên liên tục. Các chức năng của nhiều trình tự này đã được biết, từ các dữ liệu di truyền hoặc hóa sinh, hoặc bằng sự tương đồng trình tự đối với các trình tự chưa biết khác. Điều này đã giúp cho công nghệ protein một phương pháp tiếp cận với sự thiết kế hợp lý. Nhập môn Công nghệ sinh học 184
- 2. Xác định cấu trúc và mô hình hóa Các thông số về cấu trúc có độ phân giải cao, được xác định bằng tia X hoặc tinh thể học điện tử (electron crystallography) hoặc kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance-NMR), là điểm cốt lõi của sự hiểu biết về hóa sinh protein. Số lượng protein có cấu trúc độ phân giải cao đang ngày càng nhiều, nhưng vẫn còn một số lớn các trình tự đã được xác định là chưa biết. Trong lúc chờ đợi làm đầy chỗ trống trong cơ sở dữ liệu cấu trúc, khi cơ sở dữ liệu về cấu trúc toàn diện này đang được lắp ráp, thì những cố gắng khác vẫn đang được tiến hành bằng nhiều phương thức để dự báo các cấu trúc của protein. Dự báo các cấu trúc protein từ trình tự sơ cấp (cấu trúc bậc một) có một lịch sử lâu dài và được thực hiện bằng cách mô hình hóa các trình tự mới dựa trên các cấu trúc đã biết của các trình tự hoặc các tiểu trình tự (sub- sequence) tương đồng hoặc gần tương đồng bằng kỹ thuật “xâu kim thành chuỗi” (threading), trong đó một trình tự mới được so sánh trực tiếp với các kiểu cấu trúc đã biết. 3. Biến đổi trình tự Biến đổi một protein đang tồn tại bằng cách sửa đổi trình tự gen hiện nay là một công việc bình thường và lĩnh vực này bây giờ là phần ít khó khăn nhất của quá trình công nghệ. Từ đầu 1980, các phương pháp biến đổi trực tiếp protein bằng phát sinh đột biến điểm định hướng oligonucleotide (oligonucleotide-directed site mutagenesis) theo phương thức tổng hợp gen hoàn chỉnh từ các oligonucleotide primer hoặc dùng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) đã trở nên thông dụng. Các phương pháp nói trên chỉ giới hạn cho các amino acid được mã hóa bởi gen. Tuy nhiên, nhiều trình tự cũng có thể được tạo ra bằng cách tổng hợp protein theo phương pháp hóa học trong điều kiện in vitro, phương thức này cũng cho phép hợp nhất các amino acid không được mã hóa trong chuỗi protein. ▪ Các phương pháp phát sinh đột biến điểm định hướng Có hai phương pháp cơ bản để sửa đổi một trình tự mã hóa đang tồn tại của protein ở mức độ DNA. Cả hai phương pháp đều đòi hỏi gắn (ủ) một Nhập môn Công nghệ sinh học 185
- hoặc nhiều oligonucleotide (ít nhất là tạm thời) trên DNA sợi đơn (single strand DNA, ssDNA), sau đó hoạt tính DNA polymerase in vitro sẽ xúc tác để mở rộng các oligonucleotide này. Hai phương pháp đó là: - Phương pháp không dùng PCR Ở các phương pháp không dùng PCR, trình tự DNA được biến đổi liên kết với gốc tái bản (ví dụ plasmid, bacteriophage hoặc phagemid), cho phép khuếch đại in vivo kiểu gen bố mẹ hoặc kiểu gen đã được sửa đổi. Một oligonucleotide tổng hợp mang đột biến cần thiết được gắn với khuôn mẫu ssDNA mạch vòng (ví dụ genome của phage có ssDNA như M13, hoặc ФX174 hoặc dạng ssDNA của phagemid (Hình 6.2a), hoặc với một khuôn mẫu dsDNA đã được sợi đơn hóa từng phần (Hình 6.2b). Sử dụng nhiều phương pháp enzyme khác nhau có thể tạo ra khuôn mẫu ssDNA từng phần. Oligonucleotide primer đột biến Trình tự được biến đổi ssDNA vector DNA mạch vòng đóng. Sợi tái bản in vitro mang đột biến DNA polymerase + DNA ligase Vật chủ biến nạp thích hợp, vd: E. coli. Phân biệt in vivo các trình tự của bố mẹ và của đột biến heteroduplex Chọn lọc hoặc sàng lọc trình tự đột biến Hình 6.2. Phương thức phát sinh đột biến ssDNA không dùng PCR Các oligonuleotide được ủ hoạt động như một primer cho sự tổng hợp in vitro DNA bằng cách dùng enzyme DNA polymerase, thường dùng là DNA polymerase T4 hoặc T7, cùng với sự hiện diện của enzyme DNA Nhập môn Công nghệ sinh học 186
- ligase, các phân tử DNA sợi đôi (dsDNA) mạch vòng đóng sẽ được tạo ra (Hình 6.2c). DNA sợi đôi được đưa vào trong các tế bào vật chủ thích hợp để tái bản và phân chia. Sau đó, sự biến đổi mong muốn được xác định bằng một trong số phương thức sàng lọc hoặc chọn lọc. - Phương pháp dựa trên PCR Phương pháp không dùng PCR đã biết kỹ càng và được tối ưu hóa trong nhiều năm. Tuy nhiên, gần đây các phương pháp dựa trên cơ sở PCR được ứng dụng rộng rãi hơn, đặc biệt để tái sắp xếp nhanh các vùng protein nơi mà các vị trí cắt hạn chế phổ biến thường không có sẵn. Phương pháp dựa trên cơ sở PCR cho phép thực hiện sự biến đổi mong muốn và khuếch đại in vitro bằng cách ủ DNA đích (target DNA) được biến tính với một oligonucleotide mang đột biến cần thiết có thể hoạt động như một primer cho sự tái bản sợi DNA bổ sung (Hình 6.3). Có nhiều cách thức khác nhau trong phương pháp dựa trên PCR, một số trong chúng cần các vị trí cắt hạn chế ở các oligonucleotide đột biến. Điều này có thể làm giảm số lượng các phản ứng. Ví dụ: nếu ở hình 6.3, các primer A và D có các vị trí cắt hạn chế hữu ích trong các trình tự và ở D vị trí đó là từ 3’ tới trình tự đột biến, thì các sản phẩm phản ứng đầu tiên có thể được tạo dòng trực tiếp ngay sau đó. Đoạn DNA được khuếch đại sẽ liên kết với gốc tái bản của vi khuẩn trong plasmid hoặc phage và được tạo dòng bằng cách xâm nhiễm vào trong vi khuẩn. Một cách thức khác của phương pháp dựa trên PCR cho phép các trình tự riêng biệt mã hóa cho các vùng của các protein khác nhau có thể liên kết với nhau, hoặc tái tổ chức lại các vùng trong một protein. Trong phương thức này (Hình 6.4), các primer C và D là các thể lai chứa các trình tự có thể ủ với cả hai vùng (hai trình tự nucleotide). Sau đó, các phản ứng đầu tiên sẽ tạo ra các đoạn dsDNA chồng lên nhau theo trình tự và sản phẩm mong muốn có thể được tạo ra trong phản ứng thứ ba bằng cách dùng các primer A và B. Trong tất cả trường hợp, thiết kế các trình tự oligonucleotide và các điều kiện phản ứng cần phải được xem xét cẩn thận cùng với sự chọn lựa chính xác của DNA polymerase ổn nhiệt. Tuy nhiên, các phương thức này cho phép tiến hành rất nhanh và có hiệu quả rất cao. Nhập môn Công nghệ sinh học 187
- PHẢN ỨNG 1 Khuôn mẫu + primer A+D PHẢN ỨNG 2 Khuôn mẫu + primer B+C C A B D KHUẾCH ĐẠI PCR Sản phẩm AD Sản phẩm BC PHẢN ỨNG 3 Phân lập các sản phẩm AD+BC Trộn và bổ sung dư thừa các primer A và B KHUẾCH ĐẠI PCR X CẮT SẢN PHẨM AB Ở CÁC VỊ TRÍ X VÀ Y Y PHÂN LẬP VÀ GẮN VÀO VECTOR Hình 6.3. Phát sinh đột biến PCR bằng sự mở rộng chồng lấp đơn 4. Phát triển phân tử (molecular evolution) Trong nhiều trường hợp sự biến đổi có định hướng của một trình tự không phải là phương thức thích hợp để thu được kết quả mong muốn, bởi vì thường không xác định được các amino acid đích nằm ở đâu và biến đổi chúng thành cái gì. Vì thế, một số phương thức khác đã được phát triển để sản xuất và thử nghiệm các thư viện lớn hoặc các tập hợp biến thể (repertoires of variants) của một trình tự đặc biệt. Các phương thức này thường dựa vào ba đặc điểm chính: Thứ nhất, đó là nucleic acid mã hóa cho trình tự protein quan tâm duy trì liên kết vật lý với protein. Liên kết này có được nhờ sự hiện diện của protein trên bề mặt của bacteriophage hoặc vi khuẩn hoặc tế bào eukaryote và trình tự mã hóa nằm trong phage hoặc tế bào, hoặc trên polysome mà ở đó mRNA và protein mới được dịch mã vẫn còn được liên kết nhờ ribosome. Nhập môn Công nghệ sinh học 188
- PHẢN ỨNG 1 Khuôn mẫu + primer A+D PHẢN ỨNG 2 Khuôn mẫu + primer B+C A C X D Y B KHUẾCH ĐẠI PCR Sản phẩm AD Sản phẩm BC PHẢN ỨNG 3 Phân lập các sản phẩm AD + BC Trộn và bổ sung dư thừa các primer A và B KHUẾCH ĐẠI PCR X CẮT SẢN PHẨM AB Ở CÁC VỊ TRÍ X VÀ Y Y PHÂN LẬP VÀ GẮN VÀO VECTOR Hình 6.4. Dung hợp vùng PCR Thứ hai, một phương pháp được phát triển để tạo ra một số lượng lớn các biến thể bằng cách đưa các đoạn oligonucleotide thoái biến (degenerate oligonucleotide) vào trong trình tự mã hóa theo phương thức chèn đoạn cassette hoặc dùng kỹ thuật PCR, hoặc bằng phương thức phát sinh đột biến in vitro. Tuy nhiên, với các phương thức như thế thì mỗi lần chỉ có một đoạn nhỏ protein được sửa đổi. Các thư viện bị giới hạn bởi khả năng tiếp nhận các thành viên riêng rẽ của tế bào vật chủ, và trong trường hợp này thì 1012-1014 được xem là một số lượng lớn. Thứ ba, các phương pháp này đòi hỏi một phương thức sàng lọc hoặc chọn lọc từ thư viện các trình tự protein mới có kiểu hình quan tâm. Phương thức sàng lọc bao gồm việc gắn với một phối tử có thể dễ dàng thực hiện. Phương thức này cũng đòi hỏi phải có sự xúc tác và kết quả là các protein Nhập môn Công nghệ sinh học 189
- xuất hiện được giữ lại trên một giá thể rắn. Các hệ thống chọn lọc thường bao gồm sự bổ sung một chức năng cần thiết trong cơ thể vật chủ. Những protein hữu ích đã được phân lập từ các phương thức trên có thể được khuếch đại bằng cách nhân (sinh sản) phage hoặc tế bào vi khuẩn mang trình tự gen của nó, hoặc bằng cách khuếch đại trực tiếp các trình tự của chính gen nhờ kỹ thuật PCR để làm giàu trình tự mong muốn. Các phương pháp loại này nhanh chóng trở thành kỹ thuật quan trọng cho công nghệ protein và được gọi bằng thuật ngữ phát triển định hướng (directed evolution). 5. Thiết kế trình tự de novo Thiết kế de novo protein là một công việc rất phức tạp. Về nguyên tắc, đối với một protein bất kỳ có (n) gốc amino acid thì khả năng sẽ có 2×10n trình tự khác nhau. Các cơ sở dữ liệu về cấu trúc và trình tự protein cho thấy ở nhiều trình tự sự cuộn xoắn có thể được điều chỉnh tương tự nhau và như vậy chúng có thể thực hiện các chức năng như nhau. Vì thế, phương pháp tiếp cận ngược lại để chọn lựa sự cuộn xoắn thích hợp và sau đó xác định trình tự nào cần thiết để tạo ra sự cuộn xoắn và chức năng mong muốn có thể là thích hợp hơn cả. Dahiyat và Mayo (1997) đã mô tả các phương pháp máy tính để thiết kế các trình tự của vùng peptide. Chỉ khi có trình tự peptide thì protein mới có thể được xây dựng hoặc bằng tổng hợp peptide (nếu trình tự có kích thước vừa phải) hoặc bằng tổng hợp gen. Gần đây, các phương pháp khuếch đại PCR để tổng hợp gen thường được sử dụng để làm đầy và khuếch đại từng phần các oligonucleotide chồng lên nhau (overlap extension). 6. Biểu hiện Khi một trình tự mới được xác định cần phải cho nó biểu hiện để chứng minh chức năng của protein. Sự biểu hiện của các protein tái tổ hợp là một công việc vô cùng phức tạp và các hệ thống biểu hiện vật chủ ở trong phạm vi từ vi khuẩn (E. coli được sử dụng phổ biến nhất), tới nấm men (chẳng hạn Sac. cerevisiae và Pichia pastoris), tới các tế bào côn trùng và các nuôi cấy tế bào động vật có vú, và cuối cùng tới động-thực vật chuyển gen. Quy mô sản xuất protein cũng thay đổi khác nhau. Ở các giai đoạn đầu của quá trình phát triển một protein mới, ví dụ một phân tử protein được Nhập môn Công nghệ sinh học 190
- nhận dạng trong một thư viện thể hiện, thì chỉ một lượng nhỏ (µg) của protein là đủ để xác nhận một đặc tính sinh học. Trong giai đoạn hai, cần có một lượng nguyên liệu tinh sạch lớn hơn (từ 10 đến 100 mg) để thu được các thông tin về cấu trúc đặc trưng và thực hiện thêm một số thử nghiệm in vitro và in vivo. Trong một vài trường hợp, có thể cần lượng nguyên liệu được tinh sạch lớn hơn (từ vài g đến vài kg) bằng các phương thức nghiêm ngặt (và thường là tốn kém) nếu protein được sản xuất để sử dụng cho các mục đích thương mại (ví dụ các enzyme công nghiệp). Thông thường, người ta phải thử nghiệm một số phương pháp khác nhau để tìm kiếm một vật chủ biểu hiện thích hợp, vì một protein được sửa đổi sẽ không thể biểu hiện trong cùng một kiểu như trình tự của bố mẹ (thỉnh thoảng là tốt hơn, nhưng thường là không). Các yếu tố này trở nên quan trọng hơn khi nhiều phương thức dựa vào các hệ thống thư viện thể hiện, trong đó các thành viên của thư viện có thể bị mất hoặc không được miêu tả đúng mức do biểu hiện kém hoặc do cuộn xoắn không đúng. Đã có rất nhiều thử nghiệm để cải thiện sự biểu hiện và điều chỉnh sự cuộn xoắn protein của các hệ thống vật chủ, đặc biệt là E. coli. Để khắc phục một số vấn đề này, các hệ thống phiên mã-dịch mã in vitro cũng đã được sử dụng và đang được tối ưu hóa cho sản xuất ở quy mô nhỏ một cách hiệu quả các protein mới với các số lượng thích hợp cho phân tích. 7. Phân tích Cần phải có nhiều phương pháp khác nhau để phân tích đặc điểm của các protein được sửa đổi. Khi một chức năng được sửa đổi (đưa vào, biến đổi hoặc loại bỏ) thì một phương pháp thử nghiệm sinh học thích hợp có thể được phát triển để xác định khả năng của protein mới được sản xuất. Trong đó, phải đảm bảo rằng phép thử nghiệm có thể tiến hành với một lượng rất nhỏ của nguyên liệu, chẳng hạn các nguyên liệu thu được từ phương thức khuếch đại thư viện. Trong nhiều trường hợp, việc đạt được và chứng minh chức năng mới của protein là quan trọng nhất. Tuy nhiên, thêm vào các phép thử nghiệm chức năng, để giải thích các kết quả thường đòi hỏi một sự hiểu biết đầy đủ cấu trúc được sửa đổi, đặc biệt để có được sự hiểu biết sâu sắc sau này về sự cuộn xoắn của protein. Việc đánh giá số lượng trung bình của protein mới có thể được tiến hành, các tính chất thô có thể được phát hiện bằng kính Nhập môn Công nghệ sinh học 191
- quang phổ (spectroscope) hoặc các phép đo quy mô lớn khác, ví dụ: các tính chất lưỡng hướng sắc vòng (circular dichroism), độ đục (turbidity), ethalpy, độ lắng đọng (sedimentation) hoặc sắc ký (chromatography). Tuy nhiên, thông tin cấu trúc chi tiết của sản phẩm cuối cùng vẫn còn là bước hạn chế trong thiết kế và triển khai công nghệ protein thích hợp. Gần đây, kết quả của Casimiro và cộng sự (1997) đã cho thấy sự tổng hợp gen dựa trên cơ sở PCR, biểu hiện trong E. coli của một lượng protein (mg) được đánh dấu đồng vị phóng xạ và phổ NMR có thể được thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn. IV. Một số ứng dụng của công nghệ protein 1. Các đột biến điểm Các đột biến điểm riêng rẽ trong các protein có thể thu được chỉ khi có trình tự gen thuận lợi, bằng cách dùng các kỹ thuật đã được trình bày ở trên. Dưới đây là một vài ví dụ điển hình: 1.1. Betaseron/Betaferon (Interferon β-1b) Một trong những kết quả đầu tiên của công nghệ dược phẩm protein là sản xuất interferon β-1b. Protein mới này được tạo ra bởi sự thay thế của cysteine (Cys) cho serine (Ser) ở gốc thứ 17 của phân tử interferon β dài 154 amino acid. Protein được tổng hợp biểu hiện trong E. coli một hoạt tính đặc trưng gần với interferon β tự nhiên có nguồn gốc từ fibroblast. Phân tử này đã được đăng ký bản quyền từ 1993 để sử dụng cho việc làm giảm tần số và mức độ khốc liệt của sự tái phát ở những bệnh nhân đi lại được có sự tái phát yếu bệnh đa xơ cứng. 1.2. Humalog (Lispro Insulin) Humalog là một dạng biến đổi gen của insulin người trong đó hai gốc ở C-terminus của chuỗi B, proline (Pro) và lysine (Lys) ở các vị trí 28 và 29, tương ứng, được đảo ngược thứ tự của chúng. Humalog là một dạng đồng đẳng hoạt động nhanh của insulin, được thiết kế để bắt chước tốc độ đáp ứng insulin tự nhiên của cơ thể đối với thực phẩm. Sự biến đổi C-terminus được thiết kế dựa trên cơ sở cấu trúc và sự tương đồng trình tự với nhân tố sinh trưởng 1 giống insulin (insulin-like growth factor 1, IGF-1) và việc đảo Nhập môn Công nghệ sinh học 192
- ngược thứ tự đã giảm sự nhị trùng hóa (dimerization) của tiểu đơn vị B. Humalog đã được đăng ký bản quyền sử dụng trước 1996. 1.3. Các tá dược vaccine mới (adjuvants) Gần đây, các phương pháp tiếp cận mới trong việc thiết kế vaccine đã giúp cho lĩnh vực y học này có những phát triển quan trọng. Nhiều loại vaccine hiện nay là sản phẩm công nghệ sinh học rất có giá trị. Công nghệ protein đang được sử dụng để xây dựng các phân tử protein mới cung cấp sự hỗ trợ miễn dịch (adjuvant) để gây ra một đáp ứng miễn dịch đối với một kháng nguyên đồng phân phối (co-administered antigen). Các tá dược protein mới này đang được quan tâm đặc biệt nhằm kích thích các phản ứng miễn dịch mucosal sau khi chủng ngừa bằng cách uống (oral immunization) để tránh việc sử dụng phương pháp tiêm phòng vaccine (injection for vaccination). Những vaccine đã được khảo nghiệm tốt là độc tố của Vibrio cholerae (CT) và độc tố không bền nhiệt của E. coli (LT). Các cấu trúc tinh thể của CT và LT đã được làm sáng tỏ. Các thí nghiệm phát sinh đột biến điểm định hướng dựa trên cấu trúc của LT đã giúp có được sự hiểu biết đầy đủ về mối quan hệ của tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme đơn với 5 tiểu đơn vị B của các độc tố heterohexameric này, các vị trí liên kết enzyme và cofactor trong tiểu đơn vị A, cùng các điểm cắt hoạt động ở trong chúng. Các nghiên cứu này đã cho phép giải thích tại sao các độc tố đột biến vẫn ổn định để lắp ráp trong holotoxin, nhưng độc tính in vitro chỉ còn ở mức tối thiểu trong khi vẫn giữ lại các đặc tính miễn dịch và tá dược của chúng. Ví dụ: đột biến Ser thành Lys ở gốc 63 trong tiểu đơn vị A của LT ức chế sự liên kết với độc tính của NAD cofactor cho hoạt tính ADP ribosyltransferase. Đột biến S63K này cho thấy cường độ độc tính giảm sáu lần trong khi các đặc tính vẫn duy trì khả năng miễn dịch và tá dược. Một trường hợp khác, đột biến ở gốc 192 (arginine-Arg thành glycine-Gly) trong tiểu đơn vị A của LT cũng đã được thực hiện. Đột biến này xảy ra ở vị trí mà tại đó tiểu vùng A1 bị phân giải khỏi tiểu vùng A2 và đây là bước đầu tiên trong hoạt động chức năng enzyme của tiểu đơn vị A. Đột biến cũng tạo ra độc tố bất hoạt enzyme để duy trì các đặc tính tá dược. Các độc tố đột biến này hiện nay đang được Nhập môn Công nghệ sinh học 193
- thử nghiệm trong các nghiên cứu lý thuyết và lâm sàng để đánh giá lợi ích của chúng. 2. Sắp xếp lại vùng (liên kết, trao đổi và xóa bỏ) Hầu hết các protein lớn do các vùng cuộn xoắn độc lập nhỏ hơn tạo thành. Các vùng này thường được liên kết cùng với các chuỗi peptide ngắn và trong nhiều trường hợp, nhưng không phải tất cả, các vùng này có thể xác định như là các exon phân chia trong trình tự gen. Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, người ta có thể bổ sung, loại bỏ hoặc trao đổi các vùng từ một protein này tới protein khác để xây dựng lại các phân tử protein. 2.1. Các vùng liên kết 2.1.1. Các dung hợp vùng cho tế bào đích Một trong các minh họa đầu tiên của công nghệ protein là vùng có vị trí liên kết của kháng thể được liên kết di truyền với enzyme. Đơn vị kháng thể cơ bản là một cấu trúc có dạng Y hoặc T bao gồm hai chuỗi nặng có khối lượng phân tử 50 kDa và hai chuỗi nhẹ có khối lượng phân tử 25 kDa, vùng liên kết kháng nguyên được gọi là vùng Fab (antigen binding), gồm có các đầu tận cùng N của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Các đầu tận cùng C của hai chuỗi nặng cùng phối hợp để tạo thành vùng dễ kết tinh gọi vùng Fc (crystallisable). Vùng sau liên quan với những tương tác giữa các tế bào khác nhau của hệ miễn dịch và với bổ thể, cũng là yếu tố quan trọng trong việc xác định chu kỳ bán phân rã (half-life) huyết thanh của các kháng thể, ít nhất là loại IgG. Dung hợp gen enzyme-kháng thể được thực hiện bằng cách dùng trình tự DNA mã hóa cho thành phần chuỗi nặng của Fab của kháng thể để liên kết nó với trình tự mã hóa cho nuclease của khuẩn tụ cầu hoặc trình tự mã hóa cho DNA polymerase của E. coli. Các gen dung hợp sau khi được chuyển vào tế bào sản xuất chuỗi nhẹ của kháng thể đã biểu hiện và khôi phục lại cả hai hoạt tính enzyme và liên kết kháng nguyên. Các nghiên cứu đầu tiên theo hướng này đã cung cấp cơ sở cho những hướng nghiên cứu khác, trong đó một chức năng liên kết (kháng thể, cytokine, nhân tố sinh trưởng hoặc vùng liên kết phối tử ngoại bào (ECD) của thụ thể) được gắn với một chức năng của cơ quan phản ứng lại kích thích (độc tố, enzyme, Nhập môn Công nghệ sinh học 194
- cytokine). Một vùng liên kết không phải kháng thể (non-antibody) có thể được gắn với vùng Fc của một kháng thể (tận dụng ưu điểm của chu kỳ bán phân rã dài huyết thanh của các kháng thể) để cải thiện các đặc tính động học dược phẩm (pharmacokinetic) của một phân tử được thiết kế. Chẳng hạn, EnbrelTM (etanercept) gần đây đã được đăng ký bản quyền sử dụng cho người. EnbrelTM gồm có các vùng thụ thể ngoại bào cho nhân tố α gây hoại tử khối u (TNFα) được dung hợp di truyền với các vùng Fc của IgG để dùng trong việc ngăn chặn hoạt tính của TNFα. EnbrelTM hiện nay đã đăng ký bản quyền để sử dụng cho điều trị làm giảm các dấu hiệu và triệu chứng của bệnh viêm khớp từ vừa phải đến khốc liệt ở các bệnh nhân có các phản ứng không đầy đủ đối với một hoặc nhiều loại thuốc chống viêm khớp. 2.1.2. Các cytokine được dung hợp Các cytokine khác nhau thường có các chức năng chồng chéo nhau (overlapping function), hoặc có thể hoạt động hợp lực trên cùng tế bào để gây ra một thay đổi sinh lý đối với tế bào đó. Liên kết các cytokine bằng cách dung hợp các gen trong khung (in-frame) buộc hai nhóm chức năng lại với nhau và có thể về nguyên tắc dẫn đến hiệu quả sinh học mong muốn ở các liều thấp hơn nếu được thực hiện riêng rẽ. Các dung hợp kiểu này đã được thực hiện ở trường hợp interferon cách đây hơn một thập kỷ. Gần đây hơn PIXY321, một dạng dung hợp của GM-CSF và IL-3 cũng đã được khảo sát. Trong trường hợp này, các gen GM-CSF và IL-3 được sửa đổi để loại bỏ các vị trí N-glycosylation của động vật có vú và sau đó được liên kết với nhau nhờ bổ sung một đoạn nối gồm 15 amino acid linh hoạt giữa C- terminus của GM-CSF và N-terminus của IL-3. Nấm men biểu hiện PIXY321 cho thấy ái lực thụ thể đã được tăng cường, hoạt tính sinh sản và hoạt tính kích thích tạo khuẩn lạc cũng đã được so sánh với một trong số các protein khởi đầu monomer. 2.2. Trao đổi các vùng protein Một phương thức đơn giản khác được dùng trong công nghệ protein là trao đổi các vùng hoàn chỉnh, trong đó các vùng tương tự của các nguồn khác nhau được trao đổi trong một protein đa vùng để cung cấp một chức năng mới. Nhập môn Công nghệ sinh học 195
- 2.2.1. Các kháng thể khảm người-chuột Ở đây các vùng liên kết kháng nguyên ở kháng thể đơn dòng của chuột được gắn với các vùng không thay đổi (nơi cung cấp các chức năng phản ứng lại kích thích miễn dịch và điều khiển chu kỳ bán phân rã sinh học) của một kháng thể người. Sự chuyển đổi (switching) này có thể làm giảm rõ rệt khả năng tạo miễn dịch (immunogenicity) không mong muốn so với kháng thể gốc của chuột. Tới nay đã có bốn sản phẩm kháng thể khảm đã được đăng ký bản quyền là các dược phẩm, kể cả phức hợp chống tiểu huyết cầu (anti-platelet) ReoProTM. 2.2.2. Xóa các vùng Hoạt tố plasminogen mô (tPA) là một serine protease tách chiết từ các tế bào màng trong. Sau khi liên kết với fibrin, tPA hoạt hóa plasminogen thành plasmin đây là yếu tố khởi đầu phân giải huyết khối cục bộ (local thrombolysis). Reteplase là một dạng biến thể mà 3 trong 5 vùng của tPA đã bị xóa. Một trong các vùng có khả năng chọn lọc fibrin và vùng xúc tác được giữ lại. Reteplase được đăng ký bản quyền như là Retavase dùng cho việc điều trị chứng nhồi máu cơ tim cấp tính để cải thiện dòng chảy của máu (blood flow) trong tim. 3. Sắp xếp lại toàn bộ protein Nhiều protein tồn tại như là các thành viên của một họ lớn, trong đó những protein tương đồng thể hiện các hoạt tính sinh học hơi khác nhau. Ở thời kỳ đầu của công nghệ protein, các gen lai được tạo ra bằng cách dung hợp các trình tự nucleotide thông qua các vị trí cắt hạn chế thông dụng, hoặc nhờ sự tái tổ hợp in vivo giữa các gen tương đồng trong một kiểu ngẫu nhiên hơn. Các phương pháp này sản xuất một số lượng nhỏ các gen mới có thể được kiểm tra riêng rẽ. Gần đây hơn, các dạng tương đồng của protein đã được sử dụng để tạo ra các thư viện biến thể mới rất lớn. Theo phương thức này, các gen đại diện cho hai hoặc nhiều thành viên của họ được phân đoạn ngẫu nhiên bằng enzyme DNase I. Các đoạn này sau đó được dùng như các PCR primer để tạo ra các trình tự gen mới bằng cách lai ngẫu nhiên giữa các đoạn. Các biến thể mới sau đó có thể được nhận biết bằng phương thức chọn lọc hoặc sàng lọc như đã nêu trước đây. Một số trường hợp đã được tạo ra theo phương thức này là các enzyme, cytokine và các vị trí liên kết kháng thể. Nhập môn Công nghệ sinh học 196
- 4. Các tương tác protein-phối tử 4.1. Biến đổi enzyme Trong công nghệ protein, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện theo hướng thay đổi enzyme để kiểm tra và biến đổi các tương tác enzyme-cơ chất. Các loại thay đổi bao gồm: tăng hoạt tính xúc tác; biến đổi tính đặc hiệu cơ chất, kể cả sự phát sinh de novo các chức năng xúc tác mới; biến đổi các profile của pH để một enzyme có thể hoạt động trong các điều kiện không sinh lý (non-physiology); cải thiện sự chống oxy hóa bằng cách thay thế các amino acid nhạy cảm với sự oxy hóa như Cys, tryptophan (Trp) hoặc methionine (Met) bằng các amino acid không thể oxy hóa có cấu trúc không gian tương tự (sterically similar) như Ser, phenylalanine (Phe) hoặc glutamate (Glu), tương ứng; cải thiện khả năng ổn định đối với các kim loại nặng bằng cách thay thế các gốc Cys và Met và các nhóm carboxyl bề mặt; loại bỏ các kiểu phân cắt của protease; loại bỏ các vị trí mà ở đó sản phẩm xúc tác có thể liên kết theo một kiểu khác để cảm ứng sự ức chế ngược khác vị trí (allosteric). 4.2. Các chất chủ vận hormone (hormone agonist) Sự phát triển các chất siêu chủ vận (super-agonist) có hoạt tính sinh học tăng lên rõ rệt có thể làm tăng ái lực liên kết của các hormone với các receptor của chúng. Grossmann và cộng sự (1998) đã mô tả sự thiết kế các biến thể của TSH người (human thyroid-stimulating hormone) có hoạt tính tăng lên 1.300 lần. Các biến thể được thiết kế dựa trên sự tương đồng với hCG (kích dục tố màng đệm của người-human chorionic gonadotrophin), một loại glycoprotein hormone khác chia sẻ một tiểu đơn vị α chung. Sự thay thế các nhóm tích điện dương trong một vùng móc (loop region) của TSH đã phối hợp tăng hoạt tính của chúng. 4.3. Thay thế các liên kết đặc hiệu Thay thế các liên kết đặc hiệu được thực hiện bằng cách chuyển vùng đặc hiệu cho một phối tử từ một protein này đến một protein khác. Một số trường hợp đòi hỏi những thay đổi nhỏ, một số khác đòi hỏi việc chuyển đổi ở quy mô lớn của nhiều gốc. Ví dụ tính đặc hiệu của hormone prolactin được biến đổi bằng cách thay thế 8 amino acid ở receptor liên kết bề mặt sao Nhập môn Công nghệ sinh học 197
- cho hormone được biến đổi sẽ liên kết với receptor của hormone sinh trưởng. Các phân tử protein thường có các vùng loop nối giữa các kiểu cấu trúc thứ cấp khác nhau (α-helix, β-strand). Trong một số trường hợp chức năng của các gốc protein trong các loop này có thể là mục tiêu cho các thí nghiệm thay thế tương đối đơn giản. Ví dụ: đặc trưng của nhân tố sinh trưởng có tính base của fibroblast được biến đổi thành loại có tính acid bằng cách thay thế một vùng loop đặc biệt. V. Sản xuất protein trên quy mô lớn Nuôi cấy các vi sinh vật trên quy mô lớn là phương pháp kinh tế nhất do có các ưu điểm sau: - Sử dụng các môi trường đơn giản, rẻ tiền. - Các chu kỳ lên men ngắn ngày. - Có thể kiểm soát trạng thái sinh lý của vi sinh vật trong quá trình lên men và đảm bảo được tính đồng nhất của các mẻ lên men. - Có thể kế hoạch hóa việc thu hoạch protein một cách hợp lý, phù hợp với các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra. - Hiệu suất protein có thể được tăng lên nhiều lần bằng cách cải thiện các chủng truyền thống và phát triển quá trình lên men, cùng với việc sử dụng thêm công nghệ DNA tái tổ hợp. - Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cũng mở ra các cơ hội cho việc sản xuất sinh khối enzyme từ việc nuôi cấy những loài vi sinh vật đòi hỏi điều kiện sinh trưởng khắc khe như: môi trường dinh dưỡng đắt tiền hoặc phải bổ sung các nhân tố cảm ứng (inducers)... - Các enzyme của các dạng vi sinh vật sống ở điều kiện khắc nghiệt (sinh trưởng ở các điều kiện cực đoan của nhiệt độ, muối, áp lực thẩm thấu, kiềm) nhờ kỹ thuật tái tổ hợp DNA nay có thể sinh trưởng thuận lợi trong các nuôi cấy mesophilic (ưa nhiệt trung bình 20-40oC), và có thể sản xuất các enzyme với các đặc điểm chịu nhiệt hoặc chịu muối ở nồng độ cao. Nhập môn Công nghệ sinh học 198
- 1. Lên men E. coli tái tổ hợp Các enzyme có nguồn gốc từ các sinh vật prokaryote có thể được sản xuất dễ dàng trên quy mô lớn với hiệu suất cao trong các vật chủ E. coli tái tổ hợp. Các quá trình lên men này có thể được tiến hành ở quy mô từ 3.000- 6.000 L, và không đòi hỏi các bước cấy gây (inoculum cuture) phức tạp. Một cấu trúc vật chủ thích hợp cho quá trình lên men đặc trưng có thể như sau: Vật chủ E. coli mang (1) plasmid vector có gen mã hóa cho enzyme cần thiết, (2) cùng với gen chỉ thị kháng kháng sinh thích hợp như ampicillin hoặc neomycin, và (3) một nhân tố cảm ứng như là TAC (bộ ba đặc trưng cảm ứng lactose hoặc isopropylthiogalactose). Hiệu quả sản xuất cao như mong muốn có thể đạt được bằng cách lên men mẻ có cung cấp dinh dưỡng, trong đó môi trường nuôi cấy mẻ chứa các thành phần cho sự sinh trưởng ban đầu của vi khuẩn, ví dụ: glucose 2%, dịch chiết nấm men (yeast extract) 1%, phosphate 1% và các loại muối khác cùng với kháng sinh được chọn. Sau khi sự sinh trưởng ban đầu được thiết lập, các chất dinh dưỡng bổ sung được cung cấp ở các tỷ lệ thích hợp đảm bảo đủ nguồn carbon và nitrogen. Nguồn carbon thuận lợi là glucose, và nitrogen có thể là một phức hợp tự nhiên (chẳng hạn như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein), sirô ngô (corn sirup), một loại muối ammonium đơn hoặc urea. Nuôi cấy E. coli trong môi trường có bổ sung các hỗn hợp amino acid cho khả năng sinh trưởng và sản xuất protein nhanh hơn, tuy nhiên việc sử dụng các nguồn dinh dưỡng đơn giản hơn (chẳng hạn nguồn nitrogen), mặc dù có thể đòi hỏi thời gian lên men lâu hơn, vẫn có thể tạo ra sự sinh trưởng của tế bào và hiệu suất protein cao tương tự. Sản xuất enzyme được cảm ứng thuận lợi bằng cách bổ sung isopropylthiogalactoside từ 30-300 mg/L, hoặc lactose từ 1-10 g/L. Việc quyết định thời gian và tần số bổ sung chất cảm ứng là rất quan trọng để thu được hiệu suất enzyme cực đại. Mật độ tối ưu trên 200 của OD600nm (50 g khối lượng khô của tế bào/L) và sự biểu hiện protein khoảng 10 g/L (30% của protein tổng số) là một kết quả lên men mong muốn. Quá trình lên men thường thực hiện trong Nhập môn Công nghệ sinh học 199
- hai ngày ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của cơ thể, nghĩa là từ 24-28oC. 2. Lên men nấm Các loài nấm vật chủ như Aspergillus và Fusarium, và nấm men hướng methyl (Pichia) thích hợp cho sản xuất các protein glycosyl hóa từ các nguồn động vật hoặc nấm. DNA của protein được hợp nhất trực tiếp trong DNA nhiễm sắc thể cùng với hệ thống promoter điều hòa biểu hiện gen. Các vật chủ tái tổ hợp có thể được lên men trong một kiểu tương tự như các nuôi cấy không tái tổ hợp và lên men mật độ cao của tế bào có thể dễ dàng thu được bằng cách dùng các phương pháp của kỹ thuật sinh học truyền thống. Các vật chủ Aspergillus hoặc Fusarium có thể được sinh trưởng trên các nguyên liệu thô rẻ tiền như bột đậu tương có bổ sung thêm chất dinh dưỡng là sirô ngô. Nấm men, như Saccharomyces và Pichia, có thể sinh trưởng trên dịch chiết nấm men hoặc các dịch thủy phân protein và sirô ngô. Quá trình nuôi cấy có thể cho sinh khối tế bào cao bằng cách sử dụng các môi trường đã được xác định đầy đủ có bổ sung xen kẽ thêm một vài chất dinh dưỡng khác. Lên men đặc trưng kéo dài từ 4-8 ngày. Sự biểu hiện protein vượt quá 10 g/L đã thu được ở quy mô công nghiệp. 3. Các enzyme vi sinh vật thay thế các enzyme động-thực vật Một số enzyme công nghiệp vẫn được tách chiết từ các nguồn động vật như bò tiềm ẩn nguy cơ của sự nhiễm bẩn bệnh não dạng xốp của bò (bovine spongiorm encephalopathy). Chẳng hạn renin, sau khi thu từ dạ dày của bê con mới sinh sẽ được sử dụng để làm phomát. Nó vẫn không được đảm bảo liệu có hiện diện bất kỳ rủi ro nào cho sức khoẻ của người tiêu dùng hay không, tuy nhiên renin tái tổ hợp của bê con hiện nay có thể được sản xuất nhờ lên men vi sinh vật là hoàn toàn an toàn. Một cách khác, bằng phương thức tách chiết enzyme truyền thống từ các nguồn vi sinh vật và việc sử dụng kỹ thuật sàng lọc thích hợp, nhiều enzyme mới giống như enzyme động-thực vật hiện nay đã được sản xuất. Ví dụ: Nhập môn Công nghệ sinh học 200
- - Enzyme protease của Mucor trong nhiều trường hợp đã thay thế renin từ dạ dày của bê. - Protease của Aspergillus và Bacillus đã thay thế các enzyme dùng trong thuộc da. - Rất nhiều loại amylase vi sinh vật được phát triển để thay thế hoặc bổ sung cho các amylase thực vật trong tạo malt của lúa mạch hoặc lúa mỳ. - Hơn nữa, một số enzyme có nguồn gốc động vật (như hoạt tố plasminogen của mô) cũng được sản xuất trong các vi sinh vật tái tổ hợp và có thể cung cấp chuỗi protein được tái cuộn xoắn. Các enzyme glycosyl hóa của động vật có vú có thể được biểu hiện trong các cơ thể eukaryote như Saccharomyces và Aspergillus. Ở đây, vật chủ sẽ glycosyl hóa enzyme để cung cấp hoạt tính đầy đủ cho dù các đường glycosyl hóa ở đây có thể khác ở động vật có vú. Các enzyme có thể được sản xuất trực tiếp bằng nuôi cấy tế bào động vật có vú, tuy nhiên giá thành sẽ rất cao khoảng từ 1.000-5.000 USD/gram, một mức giá chỉ có thể chấp nhận cho việc sản xuất các enzyme trị liệu đặc biệt như hoạt tố plasminogen của mô hoặc các loại protein liên quan. 4. Các nguyên tắc hóa sinh cơ bản Hiệu suất lên men enzyme vi sinh vật có thể được cải thiện bằng các kỹ thuật kinh điển, tương tự các kỹ thuật dùng để cải thiện hiệu suất trong lên men kháng sinh. Cả hai sự cải thiện di truyền và quá trình lên men đã dẫn đến sự phát triển khả năng lên men trong sản xuất enzyme lên tới 20 kg/m3. Sự hiểu biết về điều hòa di truyền của quá trình tổng hợp enzyme là rất quan trọng trong việc chọn lọc các chủng đã được cải thiện và tối ưu các quá trình lên men. Có nhiều nhân tố quan trọng có thể ảnh hưởng đến sản xuất enzyme như sau: 4.1. Sự cảm ứng Sự tổng hợp enzyme thường bị ức chế (điều kiện để giúp bảo tồn năng lượng từ sự tổng hợp protein không cần thiết) tức là enzyme sẽ chỉ được sản xuất trong sự hiện diện của một chất cảm ứng, thường là cơ chất của nó. Mức độ cảm ứng (induction level) có thể là rất mạnh (tăng lên hơn 1.000 lần Nhập môn Công nghệ sinh học 201
CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD
-
Giáo trình công nghệ protein
88 p |
407 |
250
-
Giáo trình Công nghệ protein - Cao Đăng Nguyên, Đỗ Quý Hai
89 p |
267 |
154
-
CÔNG NGHỆ PROTEIN
88 p |
268 |
143
-
Giáo trình Công nghệ Protein - Cao Đăng Nguyên (chủ biên)
146 p |
235 |
125
-
Bài giảng Công nghệ protein – enzyme: Chương 3
46 p |
238 |
89
-
Công nghệ protein – enzyme
21 p |
191 |
78
-
Giáo trình Nhập môn Công nghệ sinh học - NXB Đại học Huế
322 p |
166 |
67
-
Giáo trình Công nghệ Protein part 7
15 p |
97 |
50
-
Bài giảng Công nghệ protein – enzyme: Chương 5
9 p |
160 |
41
-
Bài giảng Công nghệ protein – enzyme: Chương 4
32 p |
116 |
37
-
Bài giảng Công nghệ protein – enzyme: Chương 7
34 p |
75 |
27
-
Bài giảng Công nghệ protein - enzym: Chương 1
23 p |
112 |
26
-
Bài giảng Công nghệ protein – enzyme: Chương 2
44 p |
64 |
24
-
Bài giảng Công nghệ protein – enzyme: Chương 6
23 p |
82 |
22
-
Bài giảng Chương 1 - Công nghệ sinh học thực phẩm
70 p |
55 |
15
-
Bài giảng Chương 2 - Công nghệ sinh học trong tạo nguồn nguyên liệu cho công nghệ thực phẩm
73 p |
40 |
12
-
Bài giảng Chương 6: Công nghệ protein
55 p |
35 |
4

Server: Apache/2.2.31 (CentOS)

Cache-Control: no-store, no-cache, must-revalidate, post-check=0, pre-check=0

Set-Cookie: TLDEVNamespace=oc63rbus9efi2p08s0a46duiq6; path=/; domain=.tailieu.vn; HttpOnly


markdown:
# Đọc và viết
**Đọc và viết**
-
Cuốn "Đọc và viết thư bằng Tiếng Anh" nhằm hướng dẫn cho sinh viên cách đọc Tiếng Anh nhanh nhất, cung cấp phương pháp học Tiếng Anh nhanh nhất giúp cho các bạn mau biết đọc và viết Tiếng Anh, ngoài ra giáo trình còn kèm theo nhiều mẫu thư hướng dẫn để các bạn tham khảo.
189p
contentnew
25-04-2012
1427
671
Download
-
Giáo trình cách đọc và viết chữ Kanji - phần 1, cuốn giáo trình gồm 335 trang với khoảng 1000 chữ Kanji và các hướng dẫn khác trong viết Tiếng Nhật. Cuốn giáo trình còn có Tiếng Anh là: A Guide to Reading and Writing Japanese. Mời các bạn cùng tham khảo.
48p
huytsp
11-04-2014
266
118
Download
-
Cuốn "Đọc và viết thư bằng tiếng Anh" được biên dịch có nội dung xoay quanh những mẫu thư thương mại, cám ơn, đặt phòng ở khách sạn, hẹn gặp, hoãn lại và hủy bỏ cuộc hẹn,... Nhằm giúp các bạn có trong tay một cuốn sách quí báu để tham khảo và tự tin hơn khi viết một lá thư trong công việc. Đặc biệt, sau mỗi bài đều có phần từ vựng và những mẫu câu chuẩn để các bạn tham khảo.
189p
tengteng13
17-12-2011
185
92
Download
-
Giáo dục trẻ làm quen với chữ viết là cơ sở ban đầu giúp trẻ phát triển toàn diện, hình thành những yếu tố đầu tiên của nhân cách, chuẩn bị cho trẻ vào học lớp 1. Nhằm giúp các bạn hiểu hơn về vấn đề này, mời các bạn cùng tham khảo sáng kiến kinh nghiệm "Làm quen chữ viết cho trẻ 5-6 tuổi qua việc đọc và viết" dưới đây. Hy vọng đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho các bạn.
7p
bibapnu
07-12-2015
92
11
Download
-
Cuốn "Đọc và viết thư bằng Tiếng Anh" nhằm hướng dẫn cho sinh viên cách đọc Tiếng Anh nhanh nhất, cung cấp phương pháp học Tiếng Anh nhanh nhất giúp cho các bạn mau biết đọc và viết Tiếng Anh, ngoài ra giáo trình còn kèm theo nhiều mẫu thư hướng dẫn để các bạn tham khảo.
189p
truongdoan
27-07-2009
21337
8708
Download
-
Matt Purland đã rút ra một vài lời khuyên có thể sẽ hữu ích cho bạn trong việc học tiếng, nhất là hai kỹ năng nói và viết : “Học tiếng Anh cũng giống như tập đi xe đạp, ít ai có thể đi xe đap thành thạo khi chưa ngã vài lần”. Khi học anh văn, bạn cần phải chuẩn bị sẵn cho mình một vốn từ cơ bản chỉ ngày tháng, thời gian, thức ăn, quần áo, ... Tốt hơn hết , bạn nên học từ vựng theo chủ điểm....
7p
keysuccess
16-09-2010
374
204
Download
-
Trong tiếng Anh, cách đọc và viết ngày tháng rất đa dạng và được áp dụng theo 2 văn phong: Anh-Anh hoặc Anh-Mỹ. Dưới đây là các quy tắc chung nhất về cách đọc và viết. Hãy thực hành thật nhiều để không bị lúng túng mỗi khi viết hay đọc ngày, tháng, năm bằng tiếng Anh bạn nhé.
6p
vetnangcuoitroi_2305
24-06-2011
381
137
Download
-
Tham khảo luận văn - đề án 'đề tài "rửa tiền và chống rửa tiền - hiện tượng, giải pháp ở các nước trên thế giới và việt nam"', luận văn - báo cáo phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
85p
tiennuhoiai
18-07-2010
237
111
Download
-
Hầu hết các bạn đều rất e ngại mỗi khi gặp phải các bài tập về phân số trong tiếng Anh. Đừng lo lắng nhé! Việc đọc và viết đúng phân số sẽ rất đơn giản nếu các bạn nắm vững các qui tắc sau đây
8p
vetnangcuoitroi_2305
24-06-2011
246
99
Download
-
Vì kỹ năng đọc và viết là một trong những kỹ năng khá khó trong qua trình học tiếng Anh nên các bạn phải chuẩn bị cho mình một quá trình luyện tập phù hợp. Tài liệu
**Luyện kỹ năng đọc và viết tiếng Anh**dưới đây xin chia sẻ một vài kinh nghiệm giúp các bạn luyện tập kỹ năng đọc viết tiếng Anh của mình.
13p
anna009
12-04-2011
166
61
Download
-
Quy tắc đọc và viết ngày tháng tiếng Anh .Trong tiếng Anh, cách đọc và viết ngày tháng rất đa dạng và được áp dụng theo 2 văn phong: Anh-Anh hoặc Anh-Mỹ. Dưới đây là các quy tắc chung nhất về cách đọc và viết. Hãy thực hành thật nhiều để không bị lúng túng mỗi khi viết hay đọc ngày, tháng, năm bằng tiếng Anh bạn nhé.
11p
stylegau
21-06-2013
87
24
Download
-
Nhằm giúp các bạn củng cố lại kiến thức đã học và làm quen với dạng đề thi môn Tiếng Anh, mời các bạn cùng tham khảo "Đề thi tiếng Anh PET: Đọc và viết" dưới đây. Hy vọng đề thi sẽ giúp các bạn đạt kết quả cao trong kỳ thi sắp tới.
13p
cobedt
15-12-2015
77
21
Download
-
Chọn lọc các giáo án hay về học vần ICH, ÊCH. Giáo án sẽ trình bày ngắn gọn cho các thầy cô và các em học sinh về cấu tạo riêng của từng vần ICH, ÊCH. Thông qua các phương pháp như trực quan, thực hành giao tiếp, phân tích ngôn ngữ và rèn luyện theo mẫu, giáo án sẽ giúp các em nắm bắt nhanh chóng được các cách đọc và viết về 2 vần ICH, ÊCH. Từ đó phát triển khả năng nói của bản thân qua chủ đề "Chúng em đi du lịch".
6p
trangnt27
28-12-2013
63
11
Download
-
Một số giáo án về học vần IP – UP, hướng dẫn các em phương pháp để nhận biết cấu trúc vần, cách đọc, cách phát âm, cách viết cũng như là đánh vần cơ bản. Thông qua bài giáo án về học vần IP - UP, các em sẽ hiểu rõ hơn được cấu tạo của các vần IP, UP, các tiếng nhịp, búp. Từ đó phân biệt được sự khác nhau cơ bản giữa 2 vần này. Bên cạnh đó, các em cũng sẽ đọc và viết đúng các vần IP, UP, các từ: bắt nhịp, búp sen.
6p
lananhnn07
31-12-2013
95
9
Download
-
Qua bài học Tập đọc: Nhớ Việt Bắc GV giúp HS chú ý các từ ngữ: nắng ánh, thắt lưng, mơ nở, núi giăng. Ngắt nghỉ hơi đúng, linh hoạt giữa các dòng, các câu thơ. Hiểu ND bài: Ca ngợi đất và người Việt Bắc đẹp và đánh giặc giỏi.
3p
tantainguyen15121975
18-04-2014
72
7
Download
-
[Luận văn Thạc sĩ Tâm lý học: Hình thành kỹ năng đọc và viết cho học sinh lớp 1 dân tộc Khmer chậm biết đọc, biết viết ở huyện Tri Tôn tỉnh An Giang](https://tailieu.vn/doc/luan-van-thac-si-tam-ly-hoc-hinh-thanh-ky-nang-doc-va-viet-cho-hoc-sinh-lop-1-dan-toc-khmer-cham-bi-1880421.html)
Luận văn Thạc sĩ Tâm lý học: Hình thành kỹ năng đọc và viết cho học sinh lớp 1 dân tộc Khmer chậm biết đọc, biết viết ở huyện Tri Tôn tỉnh An Giang được thực hiện nhằm đề xuất một số biện pháp nhằm hình thành kỹ năng đọc và viết của học sinh lớp 1 dân tộc Khmer chậm biết đọc, biết viết ở huyện Tri Tôn tỉnh An Giang.
74p
maiyeumaiyeu06
20-08-2016
29
7
Download
-
Qua bài học Luyện từ và câu: Đọc và trả lời câu hỏi GV giúp HS nhận biết hiện tượng nhân hoá trong các đoạn thơ, đoạn văn, những cách nhân hoá được tác giả sử dụng. Bước đầu nói được cảm nhận về những hình ảnh nhân hoá đẹp.
3p
tantainguyen15121975
22-04-2014
45
4
Download
-
Tham khảo tài liệu '10 lời khuyên hữu ích để nói và viết tiếng anh', ngoại ngữ, anh văn giao tiếp phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
2p
ocean123
23-03-2010
898
382
Download
-
Tham khảo tài liệu '10 lời khuyên khi nói và viết tiếng anh', ngoại ngữ, anh văn giao tiếp phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả
2p
quocktv
06-03-2011
255
149
Download
-
Quy tắc đọc và viết ngày tháng bằng tiếng Anh Trong tiếng Anh, cách đọc và viết ngày tháng rất đa dạng và được áp dụng theo 2 văn phong: Anh-Anh hoặc Anh-Mỹ. Dưới đây là các quy tắc chung nhất về cách đọc và viết.
8p
miumiu111
30-03-2011
331
131
Download

WARC-Type: response

Content-Type: application/http; msgtype=response

WARC-Identified-Payload-Type: application/xhtml+xml

Connection: close

Pragma: no-cache

Set-Cookie: TLDEVNamespace=if93qnb51oqis1es2e8sl5idb6; path=/; domain=.tailieu.vn; HttpOnly

Vary: Accept-Encoding

Content-Type: text/html; charset=UTF-8


markdown:
# Chương 5: Chất khí
-
[Bài 1: Cấu tạo chất - thuyết động học phân tử](forums/bai-1-cau-tao-chat-thuyet-dong-hoc-phan-tu.389/)
- Đề tài thảo luận:
- 0
(Chưa có bài viết nào)
- Bài viết:
- 0
-
[Bài 2: Quá trình đẳng nhiệt](forums/bai-2-qua-trinh-dang-nhiet.390/)
- Đề tài thảo luận:
- 0
(Chưa có bài viết nào)
- Bài viết:
- 0
-
[Bài 3: Quá trình đẳng tích](forums/bai-3-qua-trinh-dang-tich.391/)
- Đề tài thảo luận:
- 0
(Chưa có bài viết nào)
- Bài viết:
- 0
-
[Bài 4: Phương trình trạng thái khí lí tưởng](forums/bai-4-phuong-trinh-trang-thai-khi-li-tuong.392/)
- Đề tài thảo luận:
- 0
(Chưa có bài viết nào)
- Bài viết:
- 0
-

WARC-Identified-Payload-Type: text/html

Server: nginx

X-Frame-Options: SAMEORIGIN

Set-Cookie: xf_session=70887643599f5a072b53c19cc1ea39df; path=/; secure; httponly

Vary: Accept-Encoding,User-Agent

Cache-control: private, max-age=0


markdown:
Đăng nhập / Đăng ký
Trang chủ
Thành viên
Trợ giúp
Liên hệ
Đăng nhập
Tên truy nhập
Mật khẩu
Ghi nhớ

Quên mật khẩu
ĐK thành viên
Thông tin
Giới thiệu chung
Thành tích
Cơ cấu tổ chức
Chi bộ Đảng
Công đoàn trường
Đoàn TNCS Hồ Chí Minh
Đội TNTP Hồ Chí Minh
Hội LHTN Việt Nam
Danh sách giáo viên
Danh sách lớp
Văn bản ngành
Thời khóa biểu
Tin tức
Thông báo
Hình ảnh hoạt động
Đóng góp ý kiến
Soạn bài trực tuyến
Ban giám hiệu
Ban chấp hành công đoàn
Ban chấp hành Đoàn TNCS Hồ Chí Minh
Ban chỉ huy liên đội
Ban chấp hành Hội liên hiệp TN
Các tổ chuyên môn
Thường trực Hội CMHS
Văn bản nhà trường
Văn bản Phòng giáo dục
Văn bản Sở giáo dục
Văn bản Bộ giáo dục
Tài nguyên dạy học
Clock
Các ý kiến mới nhất
Hỗ trợ trực tuyến
(Phan Văn Hùng)
(traitimbinhyen_sp87)
Thống kê
40396
truy cập (
chi tiết
)
0
trong hôm nay
71033
lượt xem
0
trong hôm nay
30
thành viên
Ảnh ngẫu nhiên
Thành viên trực tuyến
0 khách và 0 thành viên
Sắp xếp dữ liệu
Mới nhất
Tải nhiều nhất
Điều tra ý kiến
Bạn thấy trang này như thế nào?
Đẹp
Đơn điệu
Bình thường
Ý kiến khác
Gốc
>
Bài viết
>
Cơ cấu tổ chức
>
Ban chấp hành Hội liên hiệp TN
>
Tạo bài viết mới
Trường THCS Nam Thái-Nam Trực-Nam Định
Website được thừa kế từ
Violet.vn
, người quản trị:
Vũ Văn Đại
## Các ý kiến mới nhất

Server: Apache/2.2.3 (CentOS)

Content-Type: text/html; charset=utf-8


markdown:
[Gốc](/)> [Bài viết](/category/bai-viet-4767943.html)> [Văn bản ngành](/category/van-ban-nganh-4767947.html)> [Văn bản nhà trường](/category/van-ban-nha-truong-4768187.html)>
## Tờ trình đề nghị kiểm tra công nhận lại trường đạt chuẩn Quốc gia.
|
|
PHÒNG GD & ĐTNAMTRỰC
Số: 01 /TTr-THCS
|
|
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆTNAM
**TỜ TRÌNH** **Về việc đề nghị kiểm tra công nhận lại trường đạt chuẩn Quốc Gia** **đối với trường THCS Nam Thái xã Nam Thái, huyện Nam Trực** ** - Sở GD&ĐT tỉnhNam Định Kính gửi:**
- UBND huyện Nam Trực
- Phòng GD&ĐT huyện Nam Trực
- UBND xã Nam Thái
Trường THCS Nam Thái được UBND tỉnhNamĐịnh ra quyết định công nhận trường đạt chuẩn Quốc gia ngày 31 tháng 5 năm 2005. Trong nhiều năm qua, nhà trường đã từng bước nâng cao chất lượng giáo dục đào tạo, xây dựng cơ sở vật chất theo hướng chuẩn hóa, hiện đại hóa. Thực hiện nghị quyết Đại hội lần thứ XIII của Đảng bộ xã Nam Thái ngày 22 và 23 tháng 4 năm 2015 về việc tập trung nguồn lực phấn đấu xây dựng để trường THCS Nam Thái xã Nam Thái được công nhận lại là trường đạt chuẩn Quốc gia vào tháng 9 năm 2015 đáp ứng tiêu chí trong việc xây dựng nông thôn mới của xã. Được sự lãnh đạo, chỉ đạo của UBND huyện và phòng GD&ĐT huyện, từ năm học 2013 - 2014, nhà trường đã tập trung mọi nguồn lực xây dựng, bổ sung cơ sở vật chất, trang thiết bị trường học, nâng cao chất lượng giáo dục, hoàn thiện các tiêu chí của các tiêu chuẩn trường trung học đạt chuẩn Quốc gia.
Xét thấy, đến thời điểm này, sau khi tự kiểm tra, đối chiếu với các tiêu chuẩn được qui định tại thông tư 47/TT/2012-BGD&ĐT ngày 7 tháng 12 năm 2012 của Bộ GD&ĐT ban hành qui chế công nhận trường trung học cơ sở, THPT và trường phổ thông có nhiều cấp học đạt chuẩn Quốc gia. Trường THCS Nam Thái nhận thấy đã đủ điều kiện giữ vững là đạt chuẩn Quốc gia.
Trường THCS NamThái kính trình các cấp có thẩm quyền kiểm tra công nhận lại trường THCS Nam Thái đạt chuẩn Quốc gia./.
|
|
- Như kính gửi;
- Lưu VP trường;
UBND XÃNAMTHÁI
|
|
TRƯỜNG THCSNAMTHÁI
|
|
UBND HUYỆNNAMTRỰC
|
|
PHÒNG GD&ĐTNAMTRỰC
[Vũ Văn Đại](/user/show/id/3978203)@ 14:55 31/10/2015
Số lượt xem: 436
## Các ý kiến mới nhất


markdown:
### Đặc điểm nổi bật
|
|
Bánh trước với lốp không săm
Xe máy điện Aima Challenger có bánh trước với lốp không săm được thiết kế hoàn hảo, được trang bi thắng đĩa để dễ dàng điều khiển tốc độ và giảm xóc tạo cảm giác êm ái.
|
|
Đèn pha lớn và đèn xi nhan
Xe máy điện Aima Challenger có có thiết kế độc đáo, với khản năng chiếu sáng xa, làm việc ở hai chế độ, cho người sử dụng một tầm quan sát hoàn hảo. Đèn xi nhan được bố trí song song đèn pha để dễ dang quan sát.
|
|
Để chân với kiểu dáng độc đáo
Xe máy điện Aima Challenger có để chân được thiết kế với kiểu dáng độc đáo với khoảng cách hợp lý, diện tích rộng rãi và g chống trơn trướt trong các điều kiện thời tiết khác nhau cho người sử dụng cảm giác an toàn.
|
|
Yên xe đài và êm ái
Xe máy điện Aima Challenger sử dụng yên xe liền, được thiết kế dài, có thể ngồi được hai người, được làm từ các chất liệu cao cấp tạo cảm giác êm ái cho người sử dụng, phía dưới yên xe là cốp xe tiện lợi.
|
|
Đèn hậu lớn và đèn xi nhan thời trang
Xe máy điện Aima Challenger có đèn hậu lớn được thiết kế hình chóp với độ sáng cao, giúp chiếc xe dễ dàng thông báo vận tốc cho các phương tiện khac, đèn xi nhan với thiết kế đẹp mắt, phong cách với 2 đường led kéo dài.
|
|
Động cơ chính hãng Bosch
Xe máy điện Aima Challenger sử dụng đông cơ Bosch của Đức, được thiết kế theo tiêu chuẩn châu âu với độ bền cao, khản năng hoạt động mạnh mẽ, tiết kiệm năng lượng, chống nước tốt và thiết kế đẹp mắt.
[Xem thêm chi tiết sản phẩm ▼](javascript:void(0))
### Thông số kỹ thuật
Xe máy điện Aima Challenger
Chi tiết xe máy điện Aima Challenger
|
|
Thông tin chung
| Hãng sản xuất
||Aima|
|Xuất xứ||Việt Nam|
|Bảo hành Khung xe, motor||2 năm|
|Bảo hành Ác quy, bộ điều khiển||1 năm|
|
|
Ngoại hình
| Chiều dài x Chiều rộng x Chiều cao
||1640mm x 640mm x 1200mm|
|Chiều cao yên xe||750 mm|
|Đường kính bánh xe||12" x 2"|
|Mầu sắc có bán||Đủ mầu|
|
|
Tính năng
|Động cơ||1200W, 3 pha, Không chổi than|
|Cách thức thao tác||Tự động|
|Quãng đường đi được||60 - 70 Km/1 lần sạc|
|Vận tốc tối đa||30 - 40 Km/h|
|
|
Phụ kiện xe
|Ắc quy||60V - 20A|
|Sạc điện||Tự động ngắt khi Ắc quy đầy|
|Thời gian sạc||10 - 12 giờ|
|Công suất||1200W|
|Điện áp động cơ||60 V|
|Khung||Thép chắc chắn - sơn tĩnh điện|
|Điện áp||220v - 50Hz|
|
|
Chú thích
|Trọng lượng xe||90 Kg|
|Khả năng chở vật nặng||180kg|
|Bảo vệ tụt áp||51V|
|
|
Bánh xe trước sau
|Lốp không xăm, rộng hơn, bám đường|
|Giảm sóc||Trước và sau|
|Leo dốc||35 độ|
|Gương hậu||1 cặp|
|Yên xe||Yên liền|
|Chắn bùn||Trước, sau|
|Đèn pha||Đèn pha|
|Tay ga||
|
Làm việc ở 2 chế độ
**Giao hàng tận nơi miễn phí**
-Thế giới xe chạy điện sẽ chịu trách nhiệm thuê đơn vị vận chuyển giao hàng đến tận nơi khách hàng.Nếu trong quá trình vận chuyển có bất cứ vấn đề gì xẩy ra hay xe giao đến tay khách hàng có lỗi kỹ thuật thế giới xe chạy điện sẽ chịu hoàn toàn trách nhiệm và chi phí.

Cache-Control: max-age=600, private, must-revalidate


markdown:
.
THNLS CẦN THƠ- QUYỂN 4
TRANG CHỦ
THÔNG BÁO
TIN TỨC
TRANG KHOA HỌC
TRANG BẠN VIẾT
TRANG THƠ
=> Nhớ trường xưa 51
=> Giọt mưa trên lá
=> Tuyển nghệ
=> Thầm lặng
=> Hồi tưởng
=> Tuổi thơ đã mất
=> Mưa đầu năm
=> Vin câu thơ
=> Nghe mưa
=> Tự bạch
=> Bài thơ cho người...
=> Tình yêu màu gì ?
=> Sợi ngâu
=> lòng tiếc nuối
=> Đi làm ruộng...
=> Tĩnh tâm & Thực hay ảo
=> Thăm mẹ
=> Mưa đầu mùa
=> Tiễn bạn
=> Cố bằng hữu
=> Mây tương tư
=> Màu kỷ niệm
=> Mưa đầu mùa ở núi
=> Ta và Em
=> Chiều lên núi
=> Nỗi nhớ
=> Mưa thu
=> Lạc bước
=> Quỳnh tương khúc
=> Ông đồ nay
=> Tạ ơn đời
=> Mông lung nỗi sầu
=> Tình chỉ đẹp
=> Biển chiều
=> Quá khứ ...xin ngủ yên
=> Thêm ngày nữa..
=> Cơm nầy con nấu
=> Lá thư xưa
=> Diệu Sa
=> Diễn Nho
=> Dấu yêu thương
=> Ngọt ngào và êm ru
=> Đời viễn xứ
=> Phận cát
=> Nụ hồng
=> Gặp lại thầy cũ
=> Cánh thư duy nhất
=> Gặp nhau
=> Phượng xa
=> Áo màu nâu
=> Giấc mơ êm ả
=> Sầu lữ thứ
=> Áo nâu viễn xứ 509
=> Phía trước 695
=> Khúc ru tình buồn
=> Thu khúc
=> Cào cào nhớ tết trung thu
=> Ký ức đêm trăng
=> Tấm lòng của biển
=> Ánh trăng thơ
=> Trăng FB
=> Qua phà Chợ Vàm
=> Thu sang
=> Được nắm tay Anh
=> Học sinh vùng xa
=> Hương cuối mùa
=> Tình quê 776
=> Thương bạn bên sông
=> Tình muộn
=> Thu và nỗi nhớ
=> Nhớ mẹ 322
=> Trả nợ tình xa
=> Nét đẹp miền Tây
=> "Xe đạp" ơi !
=> Về quê
=> Vàng thu Quan ngọc Anh(diễn Nho)
=> Mãi tìm
=> Trường cũ
=> Như xưa
=> Tình cha
=> Giọt mưa cuối mùa
=> Trăng trên đồi
=> Hoài xưa
=> Ngày về
=> Mùa thu là mùa thơ
=> Thơ quán
=> Thơ
=> Thực và ảo
=> Đêm trăng
=> Dạ khúc,
=> Cảnh miền Tây
=> Tình buồn mùa thu 259
=> MƯa chiều thu
=> Đi biển
=> Trên đỉnh Kulen
=> Ngày không anh
=> Cõi mơ bình yên
=> Đêm trăng trong...
=> Thu Bồn, Hội An
=> Xăng Ôm
=> Mùa thu thăm núi trắng
=> Gương đời
=> Thu hãy cùng ta
=> Mùa Đông phương Nam
=> Em về
=> Tôn sư
=> Hai trong một
=> Thu xa
=> Lầu Ông Hoàng
=> Giấc thu
=> Rồi thu sẽ đi qua
=> Trường xưa
=> Thơ ghép tên
=> Về sông Vàm Cỏ Đông
=> Bài thơ tặng Người
=> Tắm biển Đồi Dương
=> Thư gởi Thầy cũ
=> Cõi mơ
=> Tình buồn mùa thu (diễn Nho)
=> Chiều mưa Mũi Né
=> Ru khúc ngàn năm
=> Vùng kỹ niệm
=> Thu khóc
=> Tình mây
=> Kiếp người và thiên thu
=> Đồi cát Hòn Rơm
=> Hoàng hôn tím
=> Tình người Đất Mũi
=> Chiều mưa Mũi Né DXT
=> Cà phê Mộng Cầm
=> Về quê nội
=> Mừng tuổi Em và Anh
=> Đánh rơi
=> Ngoại.
=> Giáng sinh
=> Noel buồn
=> Nguyên hình
=> Mùi đất mẹ
=> Trả lại tôi
=> Trăng lạnh
=> Tiển đưa
=> Huyền diệu thơ
=> Say
=> Thơ:Sống với thị phi
=> Ơn Mẹ
=> Yêu
=> Hoa tim vỡ
=> Đêm bên bờ sông
=> Giữa rừng cao su
=> Ăn sáng tại Phan Thiết
=> Lạnh cuối mùa
=> Thơ khai Xuân
=> Giấc mộng đêm xuân
=> kịch bản 40 years
=> Kịch bản 40 năm
=> Xuân muộn
=> Có khi
=> Cám ơn đời 366
=> Quỳnh hương
=> Không đề 117
=> Valentine hạnh phúc
=> Thả thơ
=> Xuân đi diễn nho
=> Giây phút chạnh lòng
=> Bà Ngoại ra nơi hò hẹn
=> Tiễn Đưa
=> Nhẫn
=> Mộng tình buồn
=> Trời mù sương
=> Mãi yêu
=> Ngày phụ nữ
=> Ngày 8 tháng 3
=> Tay trong tay
=> Đồi Sim
=> Lênh đênh
=> Tình thơ
=> Mơ hoa
=> Cảm ơn đời
=> Hư ảo
=> Rong chơi
=> Buổi tà huy
=> Ông qua xơi dùm
=> Kiếp người
=> Qua cầu Đại Ninh
=> Con quỳ lạy chúa
=> Hoàng hôn hạnh phúc
=> Trưa hè từ biệt
=> Đoản khúc tím
=> Giao mùa
=> Nhớ trường xưa,
=> Viếng người xưa
=> Tình thầy trò
=> Về thăm mẹ
=> "Cong mềm mại"
=> Giao mùa,
=> Ký ức trường xưa
=> Mua buon di vang
=> Hoa tím về đâu
=> Mai tôi đi 572
=> Nhà rường xưa
=> Trăng mơ
=> Quân tử cầm
=> Quân tử cầm 855
=> Buông xã
=> Khúc bi ai
=> Bằng lăng hoa tím
=> Ánh mắt ngày xưa
=> Ngẫm
=> Bình yên
=> Đâu phải tiền âm phủ
=> Biển vắng chân người
=> Giấc mơ xưa
=> Những đóa hồng vàng
=> Tình không giới tuyến
=> Buồn vui tự tại
=> Họp mặt trường xưa
=> Mãi mãi
=> Giấc mộng Trung Hoa
=> Nhớ Mẹ 1
=> Trường Tôi 377
=> Sống vui
=> Trở về làng quê nhỏ
=> Đồnh môn xưa và nay
=> Đừng quên 72
=> Cõi mơ không là thật
=> Hòa bình và chiến tranh
=> Thù trong-Giặc ngoài
=> Tím nhớ
=> Mãi ước
=> Hoa Dã Quỳ của ngày xưa
=> Tình Xuân 837
=> Xuân sẽ đến
=> Thơ bốn câu
=> Một con ngựa đau
=> Anh linh huyết thống..
=> Những đóa hồng vàng 777
=> TTBM Trường Xưa
=> Gái ngoan
=> Tháng năm thương nhớ
=> Lời kêu gọi
=> Sầu riêng
=> Trưa hè
=> Dưới hai màu cờ Tổ Quốc
=> Lời kêu gọi 2
=> Khi nghe Con hát
=> Tịnh
=> Hẹn hò
=> Chung sức
=> Ngày ấy bây giờ
=> Hướng Dương
=> Đời như bóng mây
=> Đừng quên
=> Cảm xúc
=> Phượng tím
=> Qua đèo
=> Ước
=> Anh là...
=> Vùng ký ức
=> Lãng mạn biển
=> Nhớ !
=> Ngày giỗ đầu của Mẹ
=> Uống rượu với Tống Giang
=> Tự tình
=> Nghỉ hè
=> Quê ngoại
=> Ngày giỗ đầu của mẹ (2)
=> Chùm tứ tuyệt
=> Lòng dạ Chệt
=> Áo nâu viễn xứ
=> Dấu tình xưa
=> Pleiku trong em
=> Bay giữa trời mây
=> Bà Nà ơi
=> Điệp khúc..chờ
=> Nhớ quê
=> Mưa xa
=> Hương tóc người xưa
=> Trăng xa
=> Tình biển đảo
=> Ai kêu nhẹ dạ
=> Công Cha
=> Đốt đuốc tìm người
=> Tơi vẫn nhớ
=> Hồi ức
=> Xa quê 581
=> Kiện đi thôi
=> Chùm thơ cuộc sống
=> Blao mưa tháng bảy
=> Ta nợ ơn người
=> Chùm thơ mùa hạ
=> Tâm sự rắn
=> Tình Xa
=> Để lại mai sau
=> Chúng ta hãy nhớ
=> Hạnh phúc
=> Kinh Pháp Cú
=> Thương về ba mẹ
=> Ba đứa
=> Mẹ tôi
=> Không đề
=> Bi thảm đời người
=> Yangon lạ lẫm
=> Tình chị sui
=> Chờ nhau
=> Vu Lan ngày giỗ Mẹ
=> Tuổi nghỉ hưu 276
=> Nỗi lòng xa xứ
=> Vu Lan báo hiếu
=> Vu lan nhớ Mẹ
=> Mùa Vu lan nhớ Mẹ
=> Mai tôi đi
=> Hai bông hồng
=> Tình mẹ
=> Lòng mẹ
=> Blao, mưa tháng bảy
=> Tình hữu nghị viển vông
=> Chiều Yangon
=> Cô phụ
=> Đò ơi
=> Diễn nho Tuổi nghỉ hưu
=> Cô gái ghe bầu
=> Cần Thơ
=> Thăm trường cũ
=> Đi tìm hôm qua
=> Hoài Thu
=> Tình Bầu
=> Ngỡ đã thăng hoa
=> Không đề 3
=> Uống rượu với La Hán
=> Hoài cảm
=> Sắc Thu
=> Hoa mắc cở
=> Phía trước
=> Tuổi học trò của tôi
=> Không đề 4
=> Dân giàu nước mạnh
=> Về quê anh
=> Cau trầu mãi đôi
=> Trăng quê
=> Tình Nông Lâm Súc 67
=> Nhận để cho
=> Hận Nam Quan
=> Niềm tin
=> Ông trăng
=> Niềm hạnh phúc
=> Hoa lục bình
=> Bến sông xưa
=> Tuổi nghỉ hưu
=> Mộng vào thu
=> Tình đồng môn
=> Ngày ấy xa rồi,
=> Tuổi nghỉ hưu 2
=> Mừng bạn
=> Gởi lời theo gió
=> Ngày ấy xa rồi
=> Trồng lúa
=> Nguyệt hạ
=> Tĩnh tâm 2
=> Nông Lâm Súc
=> Vĩnh biệt anh
=> Nguồn sống
=> Mùa tiếp mùa
=> Thôn nữ
=> Bốn mùa
=> Buồn tàn thu
=> Chợ nổi Cái Răng
=> Đến restaurant
=> Bông Điên điển
=> NLS trong thu
=> Trên đồi trà Blao
=> Không đề 5
=> Cánh thu phai
=> Màu đất mẹ
=> Mời Họp bạn
=> Hoài niệm tuổi học trò
=> Bông điên điển 2
=> Giọt mưa thu
=> Bông điên điển 3
=> Hoa vàng xưa
=> Nghiêng
=> Cám ơn đời
=> Bạc màu áo nâu
=> Bạn nhậu
=> Niệm khúc
=> Tạm biệt Yangon
=> Che
=> Mùi hương
=> Phía sau
=> Vọng phu
=> Không đề 6
=> Tuổi mộng mơ
=> Tình học trò
=> An lạc thơ
=> Thu đi
=> Tĩnh
=> Mưa Cờ Đỏ
=> Gặp bạn xưa
=> Trở về mái trường xưa
=> Mời Thu ở lại
=> Trăng khuya
=> Đông Du
=> Hòn Đá Bạc
=> Cho đời mãi hương
=> Chút xíu...ngày xưa
=> Những quãng đời
=> Thu kỷ niệm
=> Dáng thu
=> Bóng hình
=> Không đề 7
=> Đối mặt quân thù phú
=> Ngậm ngùi mưa
=> Trên đồng quê xưa
=> Đông về
=> Với biển
=> Thu cảm
=> Đau nhất
=> Dưới mưa
=> Mưa rơi
=> Khung trời ...
=> Điểm mặt quân thù phú
=> Thầy Đặng Quan Điện
=> Không đề 8 9
=> Nhớ ơn Thầy Cô
=> Ơn Thầy
=> Ký ức thời gian
=> Tìm mơ
=> Chái bếp-Nhớ ngoại
=> Uống rượu với bụi đời
=> Chiều quê
=> Thời gian nào có đợi ai
=> Thu cuối mùa
=> Thủy tinh yêu thương
=> Nhớ
=> Họp mặt Cần Thơ nhớ Ba Xuyên
=> Tấm ảnh có hồn
=> Khóc Mẹ
=> Tình Anh
=> Phất ngọn sầu đông
=> Văn điếu tham quan
=> Tình nhớ
=> Như một nén hương
=> Sống
=> Mẹ tôi
=> Hoa tím về đậu?
=> Uống rượu với gianh hồ
=> Xa quê
=> Ba chuyến xe
=> Lục bát yêu thương
=> Giáng Sinh viễn xứ
=> Về miền Đông uống rượu
=> Tiển bạn lần cuối
=> Ánh Thu xưa
=> Tình hoa mộng
=> Không đề 8
=> Cỏ cú 234
=> Bão
=> Đồng cảm
=> Giáng sinh vắng nhà
=> Tháng mười hai
=> Buồn tím sông quê
=> Đông nhớ
=> Hương hoa
=> Thơ vui Thở than
=> Viên đạn bọc đường
=> Bài thơ hay của NTHoàng
=> Bài ca dao về trăng
=> Họp mặt trường
=> Xuân đã đến
=> Bài ca dao về gió
=> Vào Xuân
=> Tình trầu cau
=> Tình nghĩa phu thê
=> Tình quê
=> Bài gợi nhớ về Châu Đốc
=> Cỏ cú
=> Sợ
=> Nhớ một người
=> Một mình
=> Bài ca dao về mưa
=> Nhớ con
=> Bài ca dao về Mây
=> Nhớ Mẹ
=> Lời yêu
=> Tô Thị rời non
=> Buồn không thể gởi...
=> Em ở lại ngắt lá dâu..
=> Ngủ đi Anh
=> Sâu lặng
=> Hơi thở
=> Một chút hương tình nầy
=> Nghe tim rụng...
=> Tiếng sáo mê hồn
=> Nhưng đẫm tình...
=> Ba chuyen xe
=> Nỗi buồn cuối năm
=> Tấm ảnh ngày xưa
=> Áo nâu xưa
=> Về quê thăm Ngoại
=> Không đề 9
=> Hoa thiếu phụ...
=> Biển mơ
=> Mười lăm năm....
=> Buồn thoang thoảng...
=> Rất riêng
=> Trong viện bảo tàng Nam Vang
=> Vui Xuân
=> Tết nhớ Cha
=> Xuân viễn xứ
=> Thiệp hồng đám cưới 205
=> Thiệp hồng đám cưới
GIẢI TRÍ
ĐIỂM BÁO
ẨM THỰC
DANH SÁCH CỰU HỌC VIÊN
ĐẶC SAN XUÂN GIÁP NGỌ
ĐẶC SAN XUÂN ẤT MÙI
"Xe đạp" ơi !
04/10/2013
Số lượt người đọc kể từ 1 July 2013: 186018 visitors (1385532 hits) on this page!
BAN ĐIỀU HÀNH
1: Võ Thanh Nghi
2: Dương Văn Phương
3: Trần Công Bình
4: NguyễnThanh Liêm
5: Lý Thái Lâm
Cố vấn: Dr Trần-Đăng Hồng
Địa chỉ liên lạc: thnlscantho.3@gmail.com
Đặc San:
Đặc san XUÂN CANH DẦN (2010)
Đặc san XUÂN TÂN MÃO (2011)
Đặc san XUÂN NHÂM THÌN (2012)
Đặc san XUÂN QUÝ TỴ (2013)
Đặc san XUÂN GIÁP NGỌ (2014)
Đặc san "Lưu Bút Ngày Xanh I (2010)
Đặc san Lưu Bút Ngày Xanh II (2011)
Đặc san Lưu Bút Ngày Xanh III (2012)
Advertisement
=> Do you also want a homepage for free? Then click here! <=

X-wm-req.backend.healthy: true

Via: 1.1 varnish-v4

Accept-Ranges: bytes

Cache-Control: no-cache, must-revalidate, s-maxage=0, max-age=0

Vary: User-Agent,Accept-Encoding

X-wm-req.backend: SitesGET

Content-Type: text/html; charset=ISO-8859-15


markdown:
...loại rủi ro pháp lý, nắm cơ hội làm giàu...
VĂN BẢN GỐC
Điều 87 Nghị định 34/2016/NĐ-CP
X
Từ khoá: Số Hiệu, Tiêu đề hoặc Nội dung ngắn gọn của Văn Bản...
Thành Viên
UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH******
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMĐộc lập - Tự do - Hạnh phúc********
Số: 944/2003/QĐ-UB
TP. Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 03 năm 2003
QUYẾT ĐỊNH
VỀ VIỆC CHỌN DOANH NGHIỆP NHÀ NƯỚC ĐỂ XÂY DỰNG ĐỀ ÁN CỔ PHẦN HÓA VÀ THÀNH LẬP BAN ĐỔI MỚI QUẢN LÝ TẠI DOANH NGHIỆP CỦA XÍ NGHIỆP IN SỐ 4
CHỦ TỊCH UBND THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Căn cứ Luật tổ chức Hội đồng nhân dân và ủy ban nhân dân ngày 21 tháng 6 năm 1994 ;Căn cứ Nghị định số 64/2002/NĐ-CP ngày 19/6/2002 của Chính phủ về việc chuyển doanh nghiệp Nhà nước thành Công ty cổ phần ;Căn cứ quyết định số 4206/QĐ-UB-KT ngày 14/8/1998 của ủy ban nhân dân thành phố Hồ Chí Minh về việc tổ chức lại Ban chỉ đạo đổi mới doanh nghiệp và Ban chỉ đạo cổ phần hóa doanh nghiệp Nhà nước thành Ban Đổi mới Quản lý doanh nghiệp thành phố ;Xét đề nghị của Thường trực Ban Đổi mới Quản lý doanh nghiệp thành phố ;
QUYẾT ĐỊNH:
Điều 1. Nay chấp thuận cho doanh nghiệp Nhà nước Xí nghiệp in số 4 thuộc Sở Văn hóa và Thông tin được tiến hành cổ phần hóa trong năm 2003 và thành lập Ban Đổi mới Quản lý tại doanh nghiệp đối với Xí nghiệp in số 4, gồm các Ông, Bà sau đây :
1- Trưởng Ban : Ông Lê Văn Tròn, Giám đốc, Bí thư Đảng ủy
2- ủy viên Thường trực : Ông Phạm Trần Thọ, Kế toán trưởng
3- Các ủy viên khác :
- Ông Nguyễn Văn Thuận, Chủ tịch Công đoàn ;
- Ông Nguyễn Văn Do, Phó Giám đốc ;
- Ông Nguyễn Văn Dủ, Phó Giám đốc Nội chính ;
- Ông Võ Tú, Trưởng phòng Tổ chức Hành chánh ;
- Ông Phan Chí Trung, Phó phòng Lao động tiền lương ;
- Bà Lê Thị Đan Phương, Phó phòng Kế hoạch ;
- Ông Trần Văn Nhanh, Phó phòng Kỹ thuật.
Quy chế và tổ chức làm việc của Ban Đổi mới Quản lý tại doanh nghiệp Xí nghiệp in số 4 do Trưởng Ban quy định trên cơ sở nội dung qui trình chuyển doanh nghiệp Nhà nước thành Công ty cổ phần.
Điều 2. Nhiệm vụ và quyền hạn của Ban Đổi mới Quản lý tại doanh nghiệp Xí nghiệp in số 4 gồm :
1- Thiết lập quy chế làm việc của Ban, phân công thành viên trong Ban thực hiện những nhiệm vụ có liên quan đã được quy định tại :
- Nghị định số 64/2002/NĐ-CP ngày 19/6/2002 của Chính phủ về việc chuyển doanh nghiệp Nhà nước thành Công ty cổ phần.
- Những Thông tư, công văn hướng dẫn triển khai công tác cổ phần hóa của các Bộ Ngành ban hành và ủy ban nhân dân thành phố, để thực hiện Nghị định số 64/2002/NĐ-CP ngày 19/6/2002 của Chính phủ.
Đảm bảo phối hợp hoạt động và tạo điều kiện cho các thành viên thực hiện tốt nhiệm vụ được giao.
2- Xác định thời điểm cổ phần hóa doanh nghiệp theo quy định của Bộ Tài chính, báo cáo về Ban Đổi mới Quản lý doanh nghiệp thành phố.
3- Thẩm định cấp cơ sở các phương án cổ phần hóa doanh nghiệp Nhà nước theo kết quả tại thời điểm cổ phần hóa nói trên theo phân cấp, gửi Ban Đổi mới Quản lý doanh nghiệp thành phố xem xét và thẩm định cấp thành phố.
4- Lập kế hoạch cổ phần hóa trong thời hạn 120 ngày (cho đến đại hội cổ đông thành lập và đăng ký kinh doanh) kể từ ngày ra quyết định này. Báo cáo tiến độ xây dựng đề án cổ phần hóa của Xí nghiệp in số 4 cho Ban Đổi mới Quản lý doanh nghiệp thành phố (28 Lê Quý Đôn, quận 3, thành phố Hồ Chí Minh) theo định kỳ vào ngày 5 mỗi tháng.
5- Báo cáo Ban Đổi mới Quản lý doanh nghiệp thành phố những vấn đề phát sinh vượt quá thẩm quyền của doanh nghiệp.
Điều 3. Ban Đổi mới Quản lý tại Xí nghiệp in số 4 được sử dụng con dấu của doanh nghiệp, lập dự toán chi phí cho việc cổ phần hóa theo các quy định của Bộ Tài chính cho đến khi hoàn thành Đại hội cổ đông thành lập Công ty cổ phần.
Điều 4. Quyết định có hiệu lực kể từ ngày ký.
Điều 5. Chánh Văn phòng Hội đồng nhân dân và ủy ban nhân dân thành phố, Trưởng Ban Đổi mới Quản lý doanh nghiệp thành phố, Trưởng Ban Tổ chức Chính quyền thành phố, Giám đốc Sở Kế hoạch và Đầu tư, Giám đốc Sở Tài chánh-Vật giá, Chi Cục trưởng Chi Cục Tài chính doanh nghiệp, Giám đốc Sở Lao động Thương binh và xã hội, Giám đốc Sở Văn hóa và Thông tin, Giám đốc Xí nghiệp in số 4, Trưởng Ban Đổi mới Quản lý tại doanh nghiệp và các Ông, Bà nói tại Điều 1 có trách nhiệm thi hành quyết định này./.
Nơi nhận : - Như điều 5 - Văn phòng Chính phủ - BCĐ ĐM & PTDN/TW- Ban TCCB Chính phủ- TT/TU, TT/HĐND. TP - TT/UBND thành phố- Ban TC/TU, LĐLĐ/TP - TT/BĐM-QLDN. TP- KBNN/TP, Cục Thuế TP - VPHĐ-UB : PVP/KT - Tổ CNN - Lưu (CNN-K)
KT. CHỦ TỊCH UBND THÀNH PHỐPHÓ CHỦ TỊCH Mai Quốc Bình
Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!
Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản,
Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn
bản tiếng Anh,...
Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên
tại đây
Tải Văn bản tiếng Việt
Bạn Đang Đăng Nhập Thành Viên Free!
Vì Đăng Nhập Thành Viên Free nên Bạn chỉ xem được
Thuộc tính và Nội dung của văn bản.
Bạn chưa xem được Nội dung toàn văn, Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế,
Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...
Nếu muốn làm Thành Viên Basic / Pro, mời Bạn Chuyển
Đổi loại Thành Viên
tại đây.
Bạn Đang Đăng Nhập Thành Viên Basic!
Vì Đăng Nhập Thành Viên Basic nên Bạn chỉ xem
được Thuộc tính, Nội dung của văn bản, Nội dung toàn
văn, Hiệu lực của Văn bản, Văn bản
liên quan, Văn bản thay thế,
Văn bản gốc.
Bạn chưa xem được Văn bản tiếng Anh, ...
Nếu muốn làm Thành Viên Pro, mời Bạn Chuyển Đổi
loại Thành Viên
tại đây.
Chú thích:
Rà chuột vào nội dụng văn bản để sử dụng.
<Nội dung> = Nội dung thay
thế tương ứng;
<Nội dung> =
Không có nội dung thay thế tương ứng;
<Nội dung> = Không có
nội dung bị thay thế tương ứng;
<Nội dung> = Nội dung được sửa đổi, bổ
sung.
Click trái để xem cụ thể từng nội dung cần so sánh
và cố định bảng so sánh.
Click phải để xem những nội dung sửa đổi, bổ sung.
Double click để xem tất cả nội dung không có thay
thế tương ứng.
Tắt so sánh [X] để
trở về trạng thái rà chuột ban đầu.
Họ & Tên:
Email:
Điện thoại:
Nội dung:
Tên truy cập hoặc Email:
Mật khẩu cũ:
Mật khẩu mới:
E-mail:
Email người nhận:
Tiêu đề Email:
Nội dung:
Email nhận thông báo:

Cache-Control: private

Set-Cookie: Culture=vi; domain=thuvienphapluat.vn; expires=Tue, 18-Jun-2019 13:11:17 GMT; path=/


markdown:
...loại rủi ro pháp lý, nắm cơ hội làm giàu...
VĂN BẢN GỐC
Điều 87 Nghị định 34/2016/NĐ-CP
X
Từ khoá: Số Hiệu, Tiêu đề hoặc Nội dung ngắn gọn của Văn Bản...
Thành Viên
ỦY
BAN NHÂN DÂN
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
------
CỘNG
HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
-------------
Số:
14/CT-UBND
TP.
Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 04 năm 1983
CHỈ THỊ
HƯỚNG DẪN VIỆC THỰC HIỆN QUỸ BẢO
TRỢ NHÀ TRƯỜNG
Từ sau ngày thành phố giải phóng
được sự quan tâm của Đảng và Nhà nước, sự nghiệp giáo dục ở thành phố không
ngừng phát triển, đáp ứng nhu cầu học tập ngày càng cao của con em nhân dân
thành phố: nhứt là đối với con em nhân dân lao động các huyện ngoại thành và
vùng ven nội đông dân mà trước đây dưới chế độ cũ phải chịu thiệt thòi nhiều
mặt.
Tuy hoàn cảnh kinh tế xã hội có
nhiều khó khăn, nhưng được sự đồng tình và tích cực hỗ trợ của các cấp chính
quyền, đoàn thể và nhân dân thành phố, mạng lưới trường lớp ngày càng được mở
rộng. Để sự nghiệp giáo dục được tiếp tục phát triển vững chắc, thực hiện
phương châm “Nhà nước và nhân dân cùng làm”, vận động toàn dân góp phần chăm lo
cho nhiệm vụ đào tạo thế hệ trẻ, ngày 14-01-1981 Hội đồng Chánh phủ đã ra quyết
định số 15/CP cho phép ngành giáo dục trong cả nước được thành lập quỹ bảo trợ nhà
trường ở các cơ sở trường học. Ngày 19-05-1982 Bộ Giáo dục đã ra thông tư số 10/TT hướng dẫn cho các
địa phương thực hiện bắt đầu từ năm học 1982-1983.
Về ý nghĩa thực tiễn, quỹ bảo
trợ nhà trường là nguồn thu ngoài ngân sách, nguồn vốn này không thay thế
cho ngân sách phường xã và Ngân sách Nhà nước chi cho công tác giáo dục
theo chỉ tiêu kế hoạch hàng năm.
Quỹ bảo trợ nhà trường bao gồm
các nguồn thu sau đây :
- Huy động sự đóng góp của cha
mẹ học sinh là những người có con em đi học.
- Sự ủng hộ của nhà hảo tâm muốn
góp phần xây dựng sự nghiệp giáo dục, góp phần chăm lo việc giáo dục thế hệ
trẻ.
- Vận động trích một phần quỹ
phúc lợi tập thể của các cơ sở sản xuất kinh doanh Nhà nước, công tư hợp doanh,
hợp tác xã và các đoàn thể xã hội… giúp đỡ các trường học.
- Thành quả lao động sản xuất
của thầy và trò tạo ra.
Tất cả các nguồn đóng góp nói
trên đều dựa trên cơ sở vận động, xuất phát từ trách nhiệm và lòng tự
nguyện đối với sự nghiệp giáo dục. Các cấp chính quyền, đoàn thể và Hội đồng
giáo dục từ thành phố đến quận huyện, phường xã cần có sự phối hợp chỉ đạo chặt
chẽ, giải thích cho cán bộ, đảng viên và nhân dân thông suốt chủ trương của
Đảng và Nhà nước, hiểu rõ mục đích ý nghĩa của việc thành lập quỹ bảo trộ nhà
trường, cảnh giác và đập tan những luận điệu xuyên tạc, phá hoại của kẻ địch và
những phần tử xấu, thực hiện tốt cuộc vận động lập quỹ bảo trợ nhà trường và
góp phần tham gia giám sát, quản lý sử dụng cho có hiệu quả thiết thực, nâng
cao chất lượng giáo dục của nhà trường.
Với ý nghĩa nói trên, căn cứ vào
đề nghị của Sở giáo dục và Hội đồng giáo dục thành phố, được sự đồng ý của Hội
đồng Nhân dân thành phố, Thường trực Uỷ ban Nhân dân thành phố cho phép ngành
giáo dục triển khai lập quỹ bảo trợ nhà trường với nội dung cụ thể như sau :
1. Về mục đích sử dụng quỹ
bảo trợ nhà trường :
Là nguồn vốn ngoài ngân sách Nhà
nước, quỹ bảo trợ nhà trường nhằm mục đích sử dụng phục vụ kịp thời cho các
hoạt động thiết thực của trường học. Cụ thể như sau :
- Góp phần vào việc sửa chữa
nhỏ, trang trí lớp học, rào dậu trường sở (ngoài quy hoạch kiến thiết xây dựng
cơ bản), mua sắm thêm đồ dùng dạy học, giấy bút sách tham khảo cho giáo viên,
sổ sách cho nhà trường…
- Góp phần cải thiện điều kiện
sinh hoạt ăn, ở, làm việc của tập thể giáo viên, kịp thời giúp đỡ các giáo viên
đau yếu, gia đình quá khó khăn…
- Góp phần hỗ trợ thêm cho công
tác khen thưởng, khuyến khích thầy dạy giỏi, trò học giỏi, ngoài kinh phí định
mức có hạn của Nhà nước.
2. Về nguồn thu và mức thu :
a) Để việc vận động sự đóng góp
của cha mẹ học sinh được dễ dàng và hợp lý, tạm thời định mức đóng góp cho từng
cấp học như sau :
- Cháu gởi nhà trẻ
:2đ/tháng
- Học sinh mẫu giáo
:3đ/tháng
- Học sinh cấp 1
:4đ/tháng
- Học sinh cấp 2
:5đ/tháng
- Học sinh cấp 3
:6đ/tháng
- Đối tượng miễn giảm :
+ Được miễn đóng góp :
- Con liệt sĩ
- Con giáo viên, cán bộ, công
nhân viên ngành giáo dục.
- Gia đình có đông con đi học
(cán bộ hoặc nhân dân) từ con thứ 3 trở đi miễn đóng góp.
- Gia đình có hoàn cảnh khó
khăn, đang được ngành thương binh xã hội trợ giá thường xuyên.
+ Được giảm 50% :
- Con thương binh
- Con cán bộ, công nhân viên và
chiến sĩ quân đội có cả cha và mẹ ăn lương trong biên chế Nhá nước (kể cả người
hưu trí).
b) Đối với các nguồn thu khác
(như vận động sự đóng góp của các nhà hảo tâm, trích phúc lợi tập thể của
các cơ sở sản xuất kinh doanh…).
- Đối với các nhà hảo tâm muốn
đóng góp giúp đỡ các trường học, thì tuỳ theo khả năng ủng hộ của từng người.
- Đối với các xí nghiệp : nhà
máy, công ty, cửa hàng… mức đóng góp trích từ quỹ phúc lợi tập thể do Đại hội
công nhân viên chức của từng đơn vị quyết định.
- Đối với các cơ sở sản xuất
kinh doanh tập thể, hợp tác xã… mức đóng góp trích từ quỹ phúc lợi tập thể do
Đại hội xã viên quyết định.
Uỷ ban Nhân dân các quận, huyện
chỉ đạo chặt chẽ với các ban ngành, phối hợp với Mặt trận và các đoàn thể để
đảm bảo cho các trường ở địa phương đều được hỗ trợ của nguồn huy động đóng góp
này, tránh tình trạng chỉ tập trung lo cho một số ít trường.
3. Về cách thu:
- Để tiện cho sự đóng góp của
cha mẹ học sinh, các trường học cần thống nhất thực hiện chế độ thu hàng
tháng (từ ngày 1 đến ngày 10 của tháng). Mỗi năm chỉ thu 9 tháng. Biên lai
thu quỹ bảo trợ nhà trường do Sở Giáo dục ấn hành thống nhất. Khi thu các trường
phải cấp biên lai cho cha mẹ học sinh.
Đối với các trường hợp riêng lẽ
do gia đình học sinh đề nghị nhà trường có thể chấp thuận việc thu theo từng
học kỳ hoặc cả năm học một lần, nhưng nhất thiết không vận động, không khuyến
khích và phải cấp biên lai đầy đủ.
- Đối với sự đóng góp của các
nhà hảo tâm, các cơ sở sản xuất kinh doanh chủ yếu dựa váo sự vận động của Hội
đồng giáo dục quận huyện, phường xã và các đoàn thể nhân dân, mỗi năm học
chỉ huy động đóng góp một lần (bằng tiền; sản phẩm hoặc vật tư, nguyên liệu
mà nhà trường có thể thể sử dụng được). Khoản đóng góp này phải có sự chứng
kiến, giám sát của Hội đồng giáo dục địa phương và Hội cha mẹ học sinh của
trường khi tiếp nhận cũng như việc bảo quản sử dụng hợp lý phục vụ cho nhiệm vụ
giáo dục.
4. Về quản lý thu chi:
Nhà trường là đơn vị quản lý thu
chi quỹ bảo trợ nhà trường. Việc quản lý thu chi phải được thực hiện chặt chẽ,
chấp hành đúng các thủ tục quy định của Bộ Giáo dục. Các khoản chi tiêu phải rõ
ràng, có chúng từ sổ sách, đúng chế độ, đúng mục đích, minh bạch, dân chủ và
đạt hiệu quả thiết thực.
Ngành giáo dục phải bảo đảm điều
kiện thuận lợi cho sự giám sát và giúp đỡ của Hội đổng giáo dục, Ban Tài chánh
giá cả, Ngân hàng quận huyện và Hội cha mẹ học sinh các trường.
Các trường học phải báo cáo
tài chánh công khai về việc thu chi quỹ bảo trợ nhà trường với Hội đồng
nhân dân và Hội cha mẹ học sinh địa phương vào cuối mỗi học kỳ và cuối năm học.
Sở Giáo dục có trách nhiệm tổ
chức hướng dẫn chu đáo các thủ tục, nguyên tắc quản lý thu chi, thực hiện đầy
đủ các hồ sơ sổ sách theo đúng quy định của Bộ Giáo dục và của ngành Tài chánh,
đồng thời có kế hoạch thường xuyên kiểm tra để phát hiện, uốn nắn kịp thời các
lệch lạc, đảm bảo cho việc sử dụng quỹ bảo trợ nhà trường đúng mục đích, đạt hiệu
quả cao, gây được sự tín nhiệm đối với cha mẹ học sinh và nhân dân thành phố.
5. Về tổ chức chỉ đạo thực
hiện:
Để thực hiện tốt chủ trương quan
trọng này, Uỷ ban Nhân dân thành phố yêu cầu các cấp chính quyền, ban ngành,
Mặt trận, đoàn thể và Hội đồng giáo dục các địa phương phải đặc biệt coi trọng
công tác giáo dục,vận động, công tác tổ chức chỉ đạo thực hiện, công tác giám
sát, kiểm tra, thanh tra, không nên giao khoán trách nhiệm cho các cấp quản lý
của ngành giáo dục, cụ thể là :
- Uỷ ban Nhân dân quận huyện,
phường xã cần báo cáo thông qua Hội đồng Nhân dân cùng cấp, dựa vào Hội đồng
giáo dục, Mặt trận và các đoàn thể của địa phương để tuyên truyền, vận động
trong cha mẹ học sinh và các tầng lớp nhân dân, trong cán bộ, công nhân, xã
viên các cơ sở sản xuất, làm cho mọi người thông suốt nhứt trí và tích cực góp
phần vào việc xây dựng quỹ bảo trợ nhà trường.
- Ngành giáo dục từ thành phố
đến các cơ sở trường học phải có kế hoạch chỉ đạo chặt chẽ, dựa vào các ban
ngành, đoàn thể và Hội cha mẹ học sinh để thực hiện đầy đủ các thủ tục, nguyên
tắc quản lý thu chi, sử dụng quỹ bảo trợ nhà trường đúng yêu cầu, đồng thời
nâng cao chất lượng dạy và học, thiết thực đem lại niềm tin cho cha mẹ học sinh
và nhân dân. Đặc biệt chú ý khi có quỹ bảo trợ nhà trường thì từ nay cấm mọi
hình thức quyên góp trong học sinh dưới bất cứ hình thức nào.
- Các cơ quan thông tấn,
báo chí, phát thanh, truyền hình thành phố có nhiệm vụ tuyên truyền phổ biến
chủ trương thành lập quỹ bảo trợ nhà trường sâu rộng trong cán bộ và nhân dân,
tạo nên công luận đồng tình, ủng hộ của các ngành, các giới và toàn dân đối với
trách nhiệm tham gia xây dựng và quản lý sự nghiệp giáo dục thành phố.
Nhận được chỉ thị này, yêu cầu
Uỷ ban Nhân dân các cấp, các ban ngành, đoàn thể hữu quan nghiên cứu nắm vững
chủ trương và có kế hoạch phối hợp chặt chẽ với ngành giáo dục để triển khai
thực hiện có kết quả tốt.
TM. ỦY BAN NHÂN DÂN
KT. CHỦ TỊCH
PHÓ CHỦ TỊCH THƯỜNG TRỰC
Lê Đình Nhơn
Bạn Chưa Đăng Nhập Thành Viên!
Vì chưa Đăng Nhập nên Bạn chỉ xem được Thuộc tính của văn bản.
Bạn chưa xem được Hiệu lực của Văn bản,
Văn bản liên quan, Văn bản thay thế, Văn bản gốc, Văn
bản tiếng Anh,...
Nếu chưa là Thành Viên, mời Bạn Đăng ký Thành viên
tại đây
Tải Văn bản tiếng Việt
Bạn Đang Đăng Nhập Thành Viên Free!
Vì Đăng Nhập Thành Viên Free nên Bạn chỉ xem được
Thuộc tính và Nội dung của văn bản.
Bạn chưa xem được Nội dung toàn văn, Hiệu lực của Văn bản, Văn bản liên quan, Văn bản thay thế,
Văn bản gốc, Văn bản tiếng Anh,...
Nếu muốn làm Thành Viên Basic / Pro, mời Bạn Chuyển
Đổi loại Thành Viên
tại đây.
Bạn Đang Đăng Nhập Thành Viên Basic!
Vì Đăng Nhập Thành Viên Basic nên Bạn chỉ xem
được Thuộc tính, Nội dung của văn bản, Nội dung toàn
văn, Hiệu lực của Văn bản, Văn bản
liên quan, Văn bản thay thế,
Văn bản gốc.
Bạn chưa xem được Văn bản tiếng Anh, ...
Nếu muốn làm Thành Viên Pro, mời Bạn Chuyển Đổi
loại Thành Viên
tại đây.
Chú thích:
Rà chuột vào nội dụng văn bản để sử dụng.
<Nội dung> = Nội dung thay
thế tương ứng;
<Nội dung> =
Không có nội dung thay thế tương ứng;
<Nội dung> = Không có
nội dung bị thay thế tương ứng;
<Nội dung> = Nội dung được sửa đổi, bổ
sung.
Click trái để xem cụ thể từng nội dung cần so sánh
và cố định bảng so sánh.
Click phải để xem những nội dung sửa đổi, bổ sung.
Double click để xem tất cả nội dung không có thay
thế tương ứng.
Tắt so sánh [X] để
trở về trạng thái rà chuột ban đầu.
Họ & Tên:
Email:
Điện thoại:
Nội dung:
Tên truy cập hoặc Email:
Mật khẩu cũ:
Mật khẩu mới:
E-mail:
Email người nhận:
Tiêu đề Email:
Nội dung:
Email nhận thông báo:

Set-Cookie: Culture=vi; domain=thuvienphapluat.vn; expires=Tue, 18-Jun-2019 13:10:49 GMT; path=/


markdown:
Nguồn: https://www.rfa.org/vietnamese/news/vietnamnews/yeu-cau-tong-bi-thu-cong-khai-tai-san-05072018142727.html
*Tổng bí thư Nguyễn Phú Trọng được yêu cầu công khai tài sản cá nhân*
Ngày 6-5-2018, ngay trước ngày khai mạc Hội nghị lần thứ 7 Ban Chấp hành Trung ương Đảng Cộng sản Việt Nam khóa XII (Hội nghị Trung ương 7) xuất hiện bức thư ký tên tập thể các đảng viên đảng cộng sản yêu cầu Tổng bí thư Nguyễn Phú Trọng phải công khai tài sản của mình.
54 người ký tên trong bức thư có những trí thức tên tuổi hiện nay như ông Nguyễn Trọng Vĩnh, nguyên Đại sứ Đặc mệnh Toàn quyền VN tại TQ, nhà văn Nguyên Ngọc, Tiến sĩ Nguyễn Quang A…
Sau đó, 16 đảng viên, công dân của xã Đồng Tâm – Hà Nội cũng ký tên vào Thư yêu cầu.
Theo nội dung bức thư, ngày 3-10-2017 Ban Bí thư Trung ương Đảng Cộng Sản Việt Nam ban hành quyết định số 99/QĐ-TƯ yêu cầu phải công khai các bản kê tài sản của cán bộ, đảng viên các cấp, và các bản kê này sẽ phải được công khai trên phương tiện thông tin đại chúng, cổng thông tin điện tử, niêm yết tại trụ sở cơ quan, đơn vị…
Tuy nhiên cho đến nay là hơn 7 tháng nhưng người dân vẫn chưa thấy được những điều này chính vì vậy, các nhân sĩ trí thức ký tên kêu gọi “Tổng Bí thư hãy làm gương là người công khai ‘Bản kê tài sản’ của mình trên báo chí, cổng thông tin điện tử và Internet trước tiên.”
Thiếu tướng Nguyễn Trọng Vĩnh, nguyên UV Ban chấp hành Trung ương Đảng Lao động Việt Nam cho biết lý do viết thư yêu cầu Tổng bí thư Nguyễn Phú Trọng công khai tài sản cá nhân:
*Dưới cái con mắt của tôi thì cái ông Tổng bí thư này chẳng đáng là cái gì. Ông ấy chẳng tích cực chống tham nhũng, đấy là bề ngoài thôi, còn người ta mà đi sâu vào thì người ta cũng thấy ông ấy có nhà, có cửa, chỗ nọ chỗ kia đấy. Tôi không phải là thám tử, tôi mà là thám tử thì tôi cũng moi cái “chống tham nhũng” của ông Trọng ra thôi vì tôi chẳng tin gì ông Nguyễn Phú Trọng đâu và tôi cũng không tin là ông ấy thanh liêm đâu.*
Việc yêu cầu công khai tài sản của người đứng đầu đảng Cộng sản VN diễn ra giữa lúc “chiến dịch chống tham nhũng” của ông Nguyễn Phú Trọng đang đến hồi cao trào, khi hàng loạt tướng tá công an, quân đội bị bắt giam, xét xử vì các sai phạm khác nhau.
Theo những người ký tên “Điều này cũng hoàn toàn phù hợp với tinh thần chỉ đạo “không có vùng cấm trong chống tham nhũng“ lâu nay của chính Ngài Tổng Bí thư: “Trước người ta bảo chỉ đánh từ vai đánh xuống, bây giờ thì ngay trên đầu làm mạnh hơn, tức là Trung ương còn nghiêm hơn cả địa phương”. Rõ ràng, đúng như lời Tổng Bí thư nói, Trung ương cần làm gương cho địa phương, và người đứng đầu Trung ương không ai khác chính là Tổng Bí thư.”

X-nananana: Batcache

X-Content-Type-Options: nosniff

Cache-Control: max-age=300, must-revalidate

Vary: Cookie