Viaje na Leitura | Sonho Realizado – Jackie Braun 17•março•2011 Livro: Sonho Realizado Série: Halequin Special – Baby on Board ISBN: 9788539800506 Quando Lauren Seville descobriu que estava grávida, soube imediatamente que sua vida mudara... pois seu maior sonho havia se realizado. A capa é tão fofa não é mesmo? E combina perfeitamente com a descrição da personagem que irá nascer em breve na vida de Lauren. Lauren descobre que está grávida, o que poderia ser uma alegria para ela, pois fora desenganada e jamais poderia gerar uma criança, é um fardo para seu marido Holden, que antes de casar com ela disse claramente que não teriam filhos, claro que na época ela aceitou a proposta, visto que nunca geraria mesmo. Mas o destino, lhe prepara uma surpresa e ela será mãe. A reação do marido? Interromper a gravidez. Insultada pela falta de amor e compaixão do marido, Lauren sai de casa atordoada com as palavras e ideia do marido, ela nunca soube que seria mãe, os médicos afirmaram que ela não seria, e agora que acontece um milagre, seu marido a abandona na ideia de conceber seu filho? Andando de carro à toa e sem rumo na vida, ela se depara em um lugar incrível, e conhece Gavin, que mesmo sendo um empresário de sucesso, se refugia no trabalho braçal de reformar casas, ele quer matar o tempo... Após se conhecerem, Lauren pede para alugar o chalé, ele estranha aquela mulher que apresenta roupas de grife e boa aparência querer se refugiar naquele lugar, mas o tempo lhe mostrará uma mulher batalhadora, guerreira e que divorcia do marido para ser mãe, aquele serzinho em seu ventre ainda não nasceu, mas a simples ideia de perdê-lo é inconcebível. Porque se sente atraída por Gavin? Gavin não quer se prender a nenhuma mulher desde que se divorciara, mas Lauren parece ser diferente. O que está acontecendo com ele? Um livro fofo e apaixonante, fiquei admirada com a audácia de Lauren e sua determinação, não é fácil uma mulher abandonar os confortos de uma vida e luxo para lutar por um sonho. Sua determinação e realização pessoal é baseada nos confortos de uma família que se forma em seu ventre, uma linda história, um livro curto e de leitura deliciosa! Recomendo!!! Sthaelle março 17, 2011 Que capa linda! *—-* quemlefazseufilme.com.br março 17, 2011 Adoro ler tudo que envolve a maternidade. A resenha me deixou querendo conferir esse enredo 🙂 Tyele março 17, 2011 Nossa.. que livrinho interessante!! A capa é uma fofura só!! ^^ Maria Lucelia - A magia da ternura março 17, 2011 Realmente a capra é muito fofa, quero muito ler esse livro. O novo visual do blog ficou maravilhoso, parabéns pelo bom gosto. anaisa março 17, 2011 Ai que lindinho, estória muito linda e capa super fofa *-* Adriana março 18, 2011 Que história linda, eu me apaixonei pelo livro só lendo a resenha! A capa é cuti-cuti demais, só quem é mãe sabe o que somos capazes de fazer por esse serzinho tão especial que colocamos no mundo né! Bjo, eu simplismente amei esse livro! amagiadosromances.com.br março 18, 2011 Sempre me emociono c/ histórias de bebês, são tão lindas! Retribuindo a visita. Eu tbm não conhecia o seu blog. Já te estou seguindo. Obrigada. MoniqueMar março 18, 2011 A capa é muito fofa e a história parece ser tambéms. Vou procurar, quero ler logo. Mariana Ribeiro março 18, 2011 A capa é muito fofa mesmo, Thaís!! Adorei a resenha, parece ser um livro de banca bem interessante mesmo. Faz tempo que não leio nada do gênero rsrs. Essa capa é coisa mais linda e cute cute do mundo o/ parece ser ootimo =D A capa é super fofa e linda! Que bebê super linda! Tadinha da Lauren. Ainda bem que ela largou o marido, mesmo isso sendo difícil. Já tenho certeza que Gavin e Lauren ficarão juntos. HUAHUA 🙂 Parabéns pela resenha, Thaís. ahhhh que fofo! deve ser muito lindo! Fábrica dos Convites março 25, 2011 Que bebê mais fofo, e pelo visto ela fez uma ótima troca. Bjs, Rose:D Convite de lançamento: Perdida de Carina Rissi


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text: Elisa Pereira, Advogada Associada da Abreu Advogados, foi a representante da Sociedade na 11th MultiLaw Academy, um evento anual organizado pela Multilaw - Multinational Association of Independent Law Firms, dedicado à formação de jovens advogados de todo o mundo. A edição deste ano, com o tema “Negotiating, Drafting & Litigating a Cross Border Contract”, decorreu em Filadélfia, entre os dias 5 e 11 de Agosto. Em análise esteve um case study sobre uma transacção internacional (fictícia), abordada a partir de três diferentes sistemas jurídicos - Direito Civil, Direito Comum (como praticado na Commonwealth) e o sistema Americano – com o objectivo de ensinar as técnicas e métodos mais eficazes para lidar com um caso semelhante. Realizaram-se ainda 8 workshops, com os seguintes temas: “Comparison of Civil Law & Common Law”, “Structuring a Transaction”, “Due Deligence”, “Introduction to Negotiating Techniques”, “Contract Negotiations”, “Cultural Differences in Doing Business”, “Breakdown of Negotiations / Dispute” e “Civil & Common Law Trial Process”. No âmbito desta iniciativa, os participantes tiveram ainda oportunidade de contribuir com trabalho pro bono para a Associação de apoio social “Philabundance” - que se dedica à distribuição de alimentos junto da população necessitada da área de Filadélfia - ajudando a empacotar vegetais para posterior distribuição. Foi a primeira vez que se realizou uma actividade deste género numa Multilaw Academy, que terá continuidade nas novas edições. A responsabilidade social tem um papel de destaque na cultura da Associação, assim como na da Abreu Advogados. As Multilaw Academies As Multilaw Academies são programas intensivos de formação em Direito Internacional para jovens advogados, em que o corpo docente é constituído por Sócios de Sociedades membros da Multilaw. Sobre a Multilaw A Multilaw foi fundada em 1990 na premissa de que escritórios de advocacia independentes podem trabalhar juntos para satisfazer as necessidades de clientes internacionais. Actualmente conta com mais de 6.000 advogados, provenientes de todo o mundo. Os objectivos da Multilaw passam por ajudar e apoiar os seus membros no desenvolvimento e na melhoria das suas práticas, através de uma grande variedade de recursos e programas, para que estes possam fornecer o melhor serviço possível aos seus clientes.


Homem leva três facadas por dívida de R$ 30 – Votunews – A notícia em primeiro lugar! sexta-feira 17 setembro 2021 / 3:39 Equipe de Força Tática da PM prendeu um rapaz de 29 anos por tentativa de homicídio na noite do último sábado, em Votuporanga Um caso de tentativa de homicídio foi registrado pelo setor policial de Votuporanga no último sábado (8). O motivo do crime: a cobrança de uma dívida de apenas R$30. Na tentativa de receber a quantia, houve uma discussão e o indivíduo “cobrador’ apanhou uma faca e desferiu três golpes contra o corpo de outro homem. O caso foi registrado por volta das 22h30 no Plantão policial Permanente. Segundo informações obtidas pela reportagem na delegacia, várias pessoas estavam em um bar, localizado na rua Angelo Petenucci, quando aconteceu uma discussão. C.W.R, 29 anos, entrou em desavença com outro indivíduo, identificado por A.C.P.S., de 39 anos, que estaria lhe devendo a quantia de R$30 e se negava a pagar. E o que era uma cobrança foi às vias de fato e C.W.R. apanhou uma faca e aplicou três golpes contra a lateral esquerda do corpo da vítima. As facadas atingiram o ombro, braço direito e axila de A.C.P.S., que seriamente ferido, foi levado por familiares, por meios próprios para atendimento no pronto Socorro da Santa Casa. Já o suspeito de praticar a agressão fugiu do local. Viaturas da Polícia Militar foram acionadas para atender a ocorrência, entre elas a equipe de Força Tática. Os policiais apuraram com testemunhas as características físicas do autor, já conhecido dos meios policiais, e após breve patrulhamento, encontraram o indivíduo na casa de familiares, a cinco quarteirões do bar onde aconteceu o crime. Diante da situação, C.W.R. recebeu voz de prisão e foi encaminhado ao Plantão Policial, onde foi reconhecido por testemunhas como autor do crime acabou indiciado pelo delegado por tentativa de homicídio. Ele foi transferido para cadeia de Jales e aguarda decisão da justiça. A arma usada no crime não foi encontrada. A Santa Casa de Votuporanga informou, por meio de boletim informativo de sua assessoria de comunicação que A.C.P.S., de 39 anos, deu entrada no Pronto Socorro no sábado, dia 8 de agosto de 2015, às 23h17, vítima de arma branca. O paciente passou por atendimento e recebeu alta a pedido no início da madrugada de domingo.


II – fixação, reajuste e aumento da remuneração dos servidores do Poder Legislativo;


text: Um local maravilhoso para visitar o Tetons tanto para fazer aqui gostaria que pudéssemos ter ficado mais. Sim, o alojamento não necessita de alguns trabalhos, mas gostei muito do café-da-manhã provavelmente o melhor de nossa viagem e realmente gostei muito da manhã as conversas com Craig e os outros hóspedes. - Opções de reserva: - O TripAdvisor tem orgulho da parceria com Expedia, para que você possa fazer suas reservas no Sassy Moose Inn com confiança. Todo mês ajudamos milhões de viajantes a encontrar o hotel perfeito para viagens de férias e de negócios, sempre com os melhores descontos e ofertas especiais.


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1. REQUISITOS PARA A INSCRIÇÃO DOS TCP Para a inscrição no Sistema de Segurança Social, os Trabalhadores por Conta Própria (TCP) devem preencher o Boletim de Identificação disponível nos serviços do INSS e no website (www.inss.gov.mz) e apresentar os seguintes documentos: a) Bilhete de identidade ou certidão de nascimento ou cédula pessoal; b) Licença de exercício de actividade ou documento emitido pelas entidades competentes equiparável a licença; c) Número Único de Identificação Tributária (NUIT). 2. TAXA DE CONTRIBUIÇÃO PARA OS TCP A taxa de contribuição para os TCP é de 7%, sendo que as contribuições para a Segurança Social são suportadas na totalidade pelos próprios trabalhadores.


source: wikipedia

text: A Reação em cadeia da polimerase - RCP em inglês polymerase chain reaction - PCR é uma técnica utilizada na biologia molecular para amplificar uma única cópia ou algumas cópias de um segmento de DNA em várias ordens de grandeza, gerando milhares a milhões de cópias de uma determinada sequência de DNA. Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis, que era um funcionário da Cetus Corporation, e também o vencedor do Prêmio Nobel de Química em 1993 junto com Michael Smith, é uma maneira fácil, barata e confiável de replicar repetidamente um segmento específico de DNA, um conceito aplicável a vários campos da biologia moderna e das ciências relacionadas. O PCR é provavelmente a técnica mais utilizada na biologia molecular. Esta técnica é utilizada na pesquisa biomédica, na forense criminal e na arqueologia molecular. O PCR é agora uma técnica comum e frequentemente indispensável usada em laboratórios clínicos e de pesquisa para uma ampla variedade de aplicações. Estes incluem a clonagem de DNA para sequenciação, clonagem e manipulação de genes, mutagênese de genes; construção de filogenias baseadas em DNA, ou análise funcional de genes; diagnóstico e monitoramento de doenças hereditárias; amplificação do DNA antigo; análise de impressões digitais genéticas para o perfil de DNA (por exemplo, na ciência forense e teste de parentesco); e detecção de patógenos em testes de ácido nucleico para o diagnóstico de doenças infecciosas. A grande maioria dos métodos de PCR dependem do ciclo térmico, o que envolve a exposição dos reagentes a ciclos de aquecimento e resfriamento repetidos, permitindo diferentes reações dependentes da temperatura - especificamente, a fusão do DNA e a replicação de DNA orientada por enzimas - para prosseguir rapidamente várias vezes em sequência. Os iniciadores (fragmentos de DNA curtos) que contêm sequências complementares à região alvo, juntamente com uma polimerase de DNA (por exemplo, Taq polimerase), após o qual o método é designado, permitem amplificação seletiva e repetida. À medida que o PCR progride, o DNA gerado é usado como um modelo para replicação, colocando em movimento uma reação em cadeia na qual o modelo de DNA original é amplificado exponencialmente. A simplicidade do princípio básico subjacente à PCR significa que pode ser amplamente modificada para realizar uma ampla gama de manipulações genéticas. O PCR não é geralmente considerado um método de DNA recombinante, pois não envolve cortar e colar DNA, apenas amplificação de sequências existentes. Quase todas as aplicações de PCR empregam uma polimerase de DNA estável ao calor, como a polimerase Taq, uma enzima originalmente isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus. Se a DNA polimerase sensível ao calor for utilizada, ela irá desnaturar todos os ciclos no passo de desnaturação. Antes do uso da Taq polimerase, a DNA polimerase teve que ser adicionada manualmente a cada ciclo, que era um processo tedioso e dispendioso. Esta DNA polimerase monta enzimaticamente uma nova cadeia de DNA a partir de nucleotídeos livres, os blocos de construção de DNA, usando DNA de cadeia simples como molde e oligonucleótidos de DNA (os iniciadores mencionados acima) para iniciar a síntese de DNA. O PCR, como a tecnologia de DNA recombinante, teve um enorme impacto nos aspectos básicos e diagnósticos da biologia molecular porque pode produzir grandes quantidades de um fragmento de DNA específico a partir de pequenas quantidades de um modelo complexo. As técnicas de DNA recombinante criam clones moleculares ao conferir a uma sequência específica a capacidade de replicar inserindo-a em um vetor e introduzindo o vetor em uma célula hospedeira. O PCR representa uma forma de "clonagem in vitro" que pode gerar, bem como modificar, fragmentos de DNA de comprimento definido e seqüência em uma simples reação automatizada. Além de suas muitas aplicações na pesquisa biológica molecular básica, o PCR promete desempenhar um papel crítico na identificação de seqüências médicamente importantes, bem como um diagnóstico importante na sua detecção. Princípios O PCR amplifica uma região específica de uma cadeia de DNA (o alvo de DNA). A maioria dos métodos de PCR amplifica os fragmentos de DNA entre 0,1 e 10 quilos de base (kbp), embora algumas técnicas permitam a amplificação de fragmentos de até 40 kbp de tamanho. A quantidade de produto amplificado é determinada pelos substratos disponíveis na reação, que se tornam limitantes à medida que a reação progride. Uma configuração básica de PCR requer vários componentes e reagentes, incluindo: um modelo de DNA que contém a região alvo de DNA para amplificar uma polimerase de DNA, uma enzima que polimeriza novas cadeias de DNA; A polimerase Taq resistente ao calor é especialmente comum, pois é mais provável que permaneça intacto durante o processo de desnaturação de DNA de alta temperatura dois iniciadores de DNA que são complementares das extremidades 3 '(três primeiras) de cada uma das cadeias sentido e anti-sentido do alvo de DNA (a polimerase de DNA só pode se ligar e alongar-se a partir de uma região de DNA de cadeia dupla, sem primers lá não é um local de iniciação de cadeia dupla no qual a polimerase pode se ligar); iniciadores específicos que são complementares da região alvo do DNA são selecionados de antemão e são geralmente feitos sob encomenda em um laboratório ou comprados de fornecedores bioquímicos comerciais desoxinucleósido trifosfatos ou dNTPs (às vezes denominados "desoxinucleótidos trifosfatos", nucleotídeos contendo grupos trifosfato), os blocos de construção a partir dos quais a DNA polimerase sintetiza uma nova cadeia de DNA uma solução tampão que fornece um ambiente químico adequado para uma atividade ótima e estabilidade da DNA polimerase catiões bivalentes, tipicamente íons de magnésio (Mg) ou manganês (Mn); Mg2 + é o mais comum, mas Mn2 + pode ser usado para mutagênese de DNA mediada por PCR, uma vez que uma maior concentração de Mn2 + aumenta a taxa de erro durante a síntese de DNA catiões monovalentes, tipicamente iões de potássio (K) A reação é comumente realizada em um volume de 10-200 μl em pequenos tubos de reação (volumes de 0,2-0,5 ml) em um termociclador. O termociclador aquece e esfria os tubos de reação para atingir as temperaturas exigidas em cada passo da reação. Muitos cicladores térmicos modernos utilizam o efeito Peltier, que permite o aquecimento e o resfriamento do bloco que contém os tubos de PCR simplesmente invando a corrente elétrica. Os tubos de reação de paredes finas permitem uma condutividade térmica favorável para permitir o equilíbrio térmico rápido. A maioria dos termostatos têm tampas aquecidas para evitar a condensação no topo do tubo de reação. Os termocicladores mais antigos que não possuem uma tampa aquecida requerem uma camada de óleo em cima da mistura de reação ou uma bola de cera dentro do tubo. Fases do PCR Normalmente, a PCR consiste em uma série de 20–40 mudanças de temperatura repetidas, chamadas ciclos, com cada ciclo geralmente consistindo em duas ou três etapas de temperatura discretas (veja a figura abaixo). O ciclismo é muitas vezes precedido por um único passo de temperatura a uma temperatura muito alta (> 90 °C) e seguido por uma retenção no final para a extensão final do produto ou armazenamento breve. As temperaturas utilizadas e o período de tempo aplicado em cada ciclo dependem de uma variedade de parâmetros, incluindo a enzima utilizada para a síntese de DNA, a concentração de íons bivalentes e dNTPs na reação e a temperatura de fusão (Tm) dos primers . As etapas individuais comuns à maioria dos métodos de PCR são as seguintes: Inicialização: este passo é necessário apenas para polimerases de DNA que requerem ativação de calor por PCR de inicialização a quente. Consiste em aquecer a câmara de reação a uma temperatura de 94–96 °C, ou 98 °C, se forem utilizadas polimerases extremamente termostáticas, que é então mantida durante 1-10 minutos. Desnaturação: Este passo é o primeiro evento regular dos ciclos e consiste em aquecer a câmara de reação a 94–98 °C por 20 a 30 segundos. Isso faz com que a fusão do DNA, ou a desnaturação, do modelo de DNA de cadeia dupla rompa as ligações de hidrogênio entre bases complementares, produzindo duas moléculas de DNA de cadeia simples. Anelamento: no próximo passo, a temperatura de reação é reduzida para 50-65 °C durante 20-40 segundos, permitindo o anelamento dos iniciadores para cada um dos modelos de DNA de cadeia simples. Dois iniciadores diferentes são tipicamente incluídos na mistura de reação: um para cada um dos dois complementos de cadeia simples contendo a região alvo. Os primers são sequências de cadeia simples, mas são muito menores do que o comprimento da região alvo, complementando apenas sequências muito pequenas na extremidade 3 'de cada vertente. É fundamental determinar uma temperatura adequada para o passo de recozimento porque a eficiência e a especificidade são fortemente afetadas pela temperatura de recozimento. Esta temperatura deve ser suficientemente baixa para permitir a hibridação do iniciador à cadeia, mas suficientemente alta para que a hibridação seja específica, isto é, o iniciador deve unir-se apenas a uma parte perfeitamente complementar da corda e em nenhum outro lugar. Se a temperatura for muito baixa, o iniciador pode se ligar de forma imperfeita. Se for muito alto, o iniciador pode não se ligar. Uma temperatura de recozimento típica é de cerca de 3–5 °C abaixo da Tm dos iniciadores utilizados. As ligações estáveis de hidrogênio entre bases complementares são formadas apenas quando a sequência iniciadora se aproxima muito da sequência do modelo. Durante este passo, a polimerase se liga ao híbrido molde-iniciador e começa a formação de DNA. Extensão / alongamento: a temperatura neste passo depende da DNA polimerase utilizada; a temperatura de atividade ideal para a polimerase de DNA termoestável da polimerase Taq (Thermus aquaticus) é de aproximadamente 75–80 °C, embora uma temperatura de 72 °C seja comumente usado com esta enzima. Neste passo, a DNA polimerase sintetiza uma nova cadeia de DNA complementar à cadeia de matriz de DNA por adição de dNTPs livres a partir da mistura de reação que são complementares ao modelo na direção 5' a 3', condensando o grupo 5'-fosfato dos dNTPs com o grupo 3'-hidroxi no final da cadeia de DNA nascente (alongada). O tempo preciso necessário para o alongamento depende tanto da polimerase de DNA utilizada quanto do comprimento da região alvo de DNA para amplificar. Como regra geral, na sua temperatura ideal, a maioria das polimerases de DNA polimerizam mil bases por minuto. Em condições ideais (isto é, se não houver limitações devido a substratos ou reagentes limitantes), em cada etapa de extensão / alongamento, o número de sequências alvo de DNA é duplicado. Com cada ciclo sucessivo, os fios originais do modelo mais todas as vertentes recém-geradas tornam-se fios de modelo para a próxima rodada de alongamento, levando a amplificação exponencial (geométrica) da região específica do alvo de DNA. Os processos de desnaturação, anelamento e alongamento constituem um único ciclo. São necessários vários ciclos para amplificar o alvo de DNA para milhões de cópias. A fórmula usada para calcular o número de cópias de DNA formadas após um determinado número de ciclos é 2n, onde n é o número de ciclos. Assim, um conjunto de reação para 30 ciclos resulta em 230, ou 1.073.741.824 cópias da região original do alvo de cadeia dupla. Alongamento final: Este único passo é opcional, mas é realizado a uma temperatura de 70–74 °C (a faixa de temperatura necessária para a atividade ideal da maioria das polimerases utilizadas na PCR) durante 5–15 minutos após o último ciclo de PCR para garantir que qualquer DNA de cadeia simples restante seja completamente alongado. Suporte final: o passo final arrefece a câmara de reação a 4–15 °C por tempo indeterminado e pode ser empregado para o armazenamento a curto prazo dos produtos de PCR. Aplicações A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações da PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo que contenham bulbo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pelo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de impressão digital genética. A PCR também é rotineiramente utilizada em procedimentos científicos de biologia molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizada para identificação de patógenos que estão presentes em amostras, como por exemplo a identificação de agentes como Candida sp, Chlamydia trachomatis, HPV (Vírus do papiloma humano) e seus genótipos, HIV, Vírus da Hepatite B, etc. A PCR também é utilizada na paleontologia para o sequenciamento gênico de animais pré-históricos. Também é muito utilizada na identificação de micro-organismos, tendo em vista que apenas 1% dos micro-organismos são cultiváveis e podendo ser isolados. A PCR é o primeiro passo para o posterior sequenciamento. Após obter as sequências geradas pelos equipamentos, pode-se consultar bases de dados na internet para tentar localizar suas possíveis origens, sendo bactérias, archeas ou etc. Procedimentos A reação em cadeia da polimerase é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o processo de polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e anti-sense são muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de temperatura. Os ciclos são pensados para disponibilizar o sitio alvo para a ligação dos primers, funcionamento da polimerase e início de um novo ciclo. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações. Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers (também chamados de oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima Taq-polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado). Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de hidrogênio). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado Variações da técnica básica de PCR PCR aninhada Utilizado para aumentar a quantidade de produto amplificado final ou para aumentar a sensibilidade da técnica. Suas reações requerem dois pares de primers, um par mais externo para a 1a reação e outro interno ao produto da 1a reação. A 1a reação necessita de um maior tempo de extensão devido ao maior tamanho do produto a ser amplificado, em seguida adiciona-se uma alíquota da 1a reação, que servirá de molde na mistura da 1a reação. O produto da 1a reação normalmente não é notado em corrida em gel de agarose. Por outro lado, o produto da 2a reação gerado em grande quantidade o é, por isso pode ser visualizado na corrida eletroforética ou utilizado para sequenciamento. Hot Start A reação de PCR é ativada quando a temperatura atinge 960C. Esse procedimento aumenta a especificidade da PCR, pois a DNA polimerase contém um anticorpo, que se desnatura e ativa a enzima ao atingir esta temperatura. DNA polimerases que não possuem esse inibidor podem amplificar produtos indesejados (inespecíficos) em temperatura ambiente. Galeria de imagens Ver também Genética Biologia Molecular Bibliografia Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, e H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988): 487-491. United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction, Patente Número - US 5656493 Elizabeth van Pelt-Verkuil, Alex van Belkum, John P. Hays, Principles and Technical Aspects of PCR Amplification , Springer Science & Business Media, 2008 ISBN 1-402-06241-9 School of Public Health University of California Eva Harris Faculty, Berkeley, A Low-Cost Approach to PCR : Appropriate Transfer of Biomolecular Techniques: Appropriate Transfer of Biomolecular Techniques , Oxford University Press, 1998 , ISBN 0-198-02801-6 Bruce A. White, PCR Protocols: Current Methods and Applications, Springer Science & Business Media, 1993, ISBN 1-592-59502-2 Ralph Rapley, PCR Sequencing Protocols, Humana Press, 1996 ISBN 0-896-03344-9 Ligações externas Filme didático, sobre todo o protocolo desta técnica de biologia molecular (1). Filme didático, sobre todo o protocolo desta técnica de biologia molecular (2). Filme didático, sobre todo o protocolo desta técnica de biologia molecular (3). Animação em Flash, Principio da PCR de forma prática e simples de visualizar (1). Animação em Flash, Principio da PCR de forma prática e simples de visualizar (2). Informação sobre todos os aspectos técnicos dos diferentes tipos de PCR. Ciência Forense: exame de ADN - Prof. Emiliano Chemello Genética Biologia molecular Técnicas em biologia molecular


text: Em ciência da computação, uma expressão regular (do inglês regular expression, abreviado regex ou regexp) provê uma forma concisa e flexível de identificar cadeias de caracteres de interesse, como caracteres particulares, palavras ou padrões de caracteres. Expressões regulares são escritas numa linguagem formal que pode ser interpretada por um processador de expressão regular, um programa que serve um gerador de analisador sintático ou examina o texto e identifica as partes que casam com a especificação dada. O termo deriva do trabalho do matemático norte-americano Stephen Cole Kleene, que desenvolveu as expressões regulares como uma notação ao que ele chamava de álgebra de conjuntos regulares. Seu trabalho serviu de base para os primeiros algoritmos computacionais de busca, e depois para algumas das mais antigas ferramentas de tratamento de texto da plataforma Unix. O uso atual de expressões regulares inclui procura e substituição de texto em editores de texto e linguagens de programação, validação de formatos de texto (validação de protocolos ou formatos digitais), realce de sintaxe e filtragem de informação. Conceitos básicos Uma expressão regular (ou, um padrão) descreve um conjunto de cadeias de caracteres, de forma concisa, sem precisar listar todos os elementos do conjunto. Por exemplo, um conjunto contendo as cadeias "Handel", "Händel" e "Haendel" pode ser descrito pelo padrão H(ä|ae?)ndel. A maioria dos formalismos provê pelo menos três operações para construir expressões regulares. Alternância Uma barra vertical (|) separa alternativas. Por exemplo, psicadélico|psicodélico pode casar "psicadélico" ou "psicodélico". Agrupamento Parênteses ((, )) são usados para definir o escopo e a precedência de operadores, entre outros usos. Por exemplo, psicadélico|psicodélico e psic(a|o)délico são equivalentes e ambas descrevem "psicadélico" e "psicodélico". Quantificação (ou repetição) Um quantificador após um token (como um caractere) ou agrupamento especifica a quantidade de vezes que o elemento precedente pode ocorrer. Os quantificadores mais comuns são o ponto de interrogação ?, o asterisco * e o sinal de adição +. ? indica que há zero ou uma ocorrência do elemento precedente. Por exemplo, ac?ção casa tanto "acção" quanto "ação". * indica que há zero ou mais ocorrências do elemento precedente. Por exemplo, ab*c casa "ac", "abc", "abbc", "abbbc", e assim por diante. + indica que há uma ou mais ocorrências do elemento precedente. Por exemplo, ab+c casa "abc", "abbc", "abbbc", e assim por diante, mas não "ac". Essas construções podem ser combinadas arbitrariamente para formar expressões complexas, assim como expressões aritméticas com números e operações de adição, subtração, multiplicação e divisão. De forma geral, há diversas expressões regulares para descrever um mesmo conjunto de cadeias de caracteres. A sintaxe exata da expressão regular e os operadores disponíveis variam entre as implementações. História A origem das expressões regulares está na teoria dos autômatos e na teoria das linguagens formais, e ambas fazem parte da teoria da computação. Esses campos estudam modelos de computação (autômatas) e formas de descrição e classificação de linguagens formais. Na década de 1950, o matemático Stephen Cole Kleene descreveu tais modelos usando sua notação matemática chamada de "conjuntos regulares", formando a álgebra de Kleene. A linguagem SNOBOL foi uma implementação pioneira de casamento de padrões, mas não era idêntica às expressões regulares. Ken Thompson construiu a notação de Kleene no editor de texto QED como uma forma de casamento de padrões em arquivos de texto. Posteriormente, ele adicionou essa funcionalidade no editor de texto Unix ed, que resultou no uso de expressões regulares na popular ferramenta de busca grep. Desde então, diversas variações da adaptação original de Thompson foram usadas em Unix e derivados, incluindo expr, AWK, Emacs, vi e lex. As expressões regulares de Perl e Tcl foram derivadas da biblioteca escrita por Henry Spencer, e no Perl a funcionalidade foi expandida posteriormente. Philip Hazel desenvolveu a PCRE (Perl Compatible Regular Expressions), uma biblioteca usada por diversas ferramentas modernas como PHP e o servidor Apache. Parte do desenvolvimento do Perl 6 foi melhorar a integração das expressões regulares de Perl, e aumentar seu escopo e funcionalidade para permitir a definição de gramáticas de expressão de analisadores sintáticos. O resultado foi uma mini-linguagem, as regras do Perl 6, usada para definir a gramática do Perl 6 assim como fornecer uma ferramenta para programadores da linguagem. Tais regras mantiveram as funcionalidades de expressões regulares do Perl 5.x, mas também permitiram uma definição BNF de um analisador sintático descendente recursivo. O uso de expressões regulares em normas de informação estruturada para a modelagem de documentos e bancos de dados começou na década de 1960, e expandiu na década de 1980 quando normas como a ISO SGML foram consolidadas. Teoria de linguagens formais Expressões regulares podem ser expressas através da teoria de linguagens formais. Elas consistem de constantes e operadores que denotam conjuntos de cadeias de caracteres e operações sobre esses conjuntos, respectivamente. Dado um alfabeto finito Σ, as seguintes constantes são definidas: (conjunto vazio) denotando o conjunto (cadeia de caracteres vazia) ε denotando o conjunto {ε} (literal) a em Σ denotando o conjunto {a} As seguintes operações são definidas: (concatenação) RS denotando o conjunto { αβ | α em R e β em S }. Por exemplo, {"ab", "c"}{"d", "ef"} = {"abd", "abef", "cd", "cef"}. (alternância) R|S denotando o conjunto união de R e S. Usa-se os símbolos , ou para alternância ao invés da barra vertical. Por exemplo, {"ab", "c"}{"dv", "ef"} = {"ab", "c", "dv", "ef"} (Fecho de Kleene) R* denotando o menor superconjunto de R que contém ε e é fechado sob concatenação. Esse é o conjunto de todas as cadeias de caracteres que podem ser construídas ao concatenar zero ou mais cadeias em R. Por exemplo, {"ab", "c"}* = {ε, "ab", "c", "abab", "abc", "cab", "cc", "ababab", "abcab", ... }. As constantes e os operadores acima formam a álgebra de Kleene. Para evitar parênteses, é assumido que o fecho de Kleene possui a maior prioridade, depois a concatenação e por fim a alternância. Se não houver ambiguidades, os parênteses podem ser omitidos. Por exemplo, (ab)c pode ser escrito como abc, e a|(b(c*)) pode ser escrito como a|bc*. Exemplos a|b* denota {ε, a, b, bb, bbb, ...} (a|b)* denota o conjunto de todas as cadeias de caracteres que contém os símbolos a e b, incluindo a cadeia vazia: {ε, a, b, aa, ab, ba, bb, aaa, ...} ab*(c|ε) denota o conjunto de cadeias de caracteres começando com a, então com zero ou mais bs e opcionalmente com um c: {a, ac, ab, abc, abb, ...} A definição formal de expressões regulares é concisa e evita a utilização dos quantificadores redundantes ? e +, que podem ser expressados respectivamente por (a|ε) e aa*. Por vezes o operador de complemento ~ é adicionado; ~R denota o conjunto das cadeias de caracteres de Σ* que não estão em R. Esse operador é redundante, e pode ser expressado usando outros operadores, apesar da computação para tal representação ser complexa. Expressões regulares podem expressar linguagens regulares, a classe de linguagens aceita por um autômato finito. Entretanto, há uma diferença significativa na compactação. Algumas classes de linguagens regulares podem ser descritas somente por autômatos que crescem exponencialmente em tamanho, enquanto o tamanho das expressões regulares requeridas só pode crescer linearmente. Expressões regulares correspondem ao Tipo-3 das gramáticas da Hierarquia de Chomsky. Por outro lado, existe um mapeamento simples de expressões regulares para máquinas de estado finito não-determinísticas que não leva ao crescimento desgovernado do tamanho. Por essa razão, essas máquinas não determinísticas são geralmente usadas como representação alternativa das expressões regulares. É possível escrever um algoritmo que, para duas expressões regulares dadas, decide se as linguagens descritas são essencialmente iguais. Reduz-se cada expressão na máquina de estado finito mínima, e determina-se se ambas as máquinas mínimas são isomórficas (equivalentes). Vale notar que diversas implementações de expressões regulares implementam funcionalidades que não podem ser expressadas na álgebra de Kleene; ver abaixo mais sobre o assunto. Sintaxe POSIX De 1986, a norma IEEE POSIX 1003.2 (POSIX.2) padroniza expressões regulares, e fornece duas especificações, a saber: o conjunto básico (BRE) e o conjunto estendido (ERE). BRE: expressões regulares básicas A sintaxe tradicional de expressões regulares em Unix seguiu convenções comuns, mas diferiu entre as implementações. A norma IEEE POSIX BRE (Basic Regular Expressions, do inglês, expressões regulares básicas) foi desenvolvida primordialmente por compatibilidade com a sintaxe tradicional, mas fornecia uma norma comum que desde então foi adotada por diversas ferramentas. Na sintaxe de BRE, a maioria dos caracteres são tratados como literais — eles casam somente com eles próprios (por exemplo, a casa "a"). As exceções são chamadas metacaracteres ou metassequências, definidos abaixo: Uma característica da BRE é que os metacaracteres geralmente exigem barras invertidas para serem tratados como tal. Por exemplo, em BRE, a{1,2} é composto somente por literais, e casará somente "a{1,2}". Para casar entre uma a duas ocorrências de "a", deve-se usar a expressão regular a\{1,2\}. A motivação desse sistema é a compatibilidade com sistemas antigos, já que na época da padronização já havia código Unix legado que usava chaves como literais. ERE: expressões regulares estendidas O significado dos metacaracteres serem escapados com a barra invertida é revertido na sintaxe POSIX ERE (Extended Regular Expression, do inglês, expressões regulares estendidas). Isso significa que não são usadas barras invertidas para identificar metacaracteres. Pelo contrário, elas servem justamente para transformar metacaracteres em literais. Retomando o exemplo da seção anterior, em ERE, a{1,2} casa uma a duas ocorrências de "a", enquanto a\{1,2\} casa o literal "a{1,2}". Os seguintes metacaracteres foram adicionados: Ferramentas que adotaram a sintaxe incluem MySQL e PHP, esta, que suporta também as derivações de Perl no modelo do PCRE. Classes de caracteres Já que diversos grupos de caracteres dependem duma configuração de locale específica, a POSIX define algumas classes (ou categorias) de caracteres para fornecer um método padrão de acesso a alguns grupos específicos de caracteres bastante utilizados, como mostrado na seguinte tabela: Notar que as doze classes definidas acima também estão definidas na biblioteca padrão do C, na seção de funções de testes de caracteres do cabeçalho ctype.h. Tais classes só podem ser usadas dentro de expressões de listas de caracteres. Diferentes locales podem fornecer classes adicionais. Uma extensão não POSIX difundida é [:word:] (atalho do Perl \w), geralmente definida como [:alnum:] ou traço baixo (_) e [:ascii:], contendo somente caracteres ASCII ([\x01-\x7F]). Pode-se negar uma classe de caracteres precedendo um acento circunflexo ao nome da classe. Por exemplo, para negar [:digit:] usa-se [:^digit:]. Limites de palavras A norma POSIX define ainda dois metacaracteres especiais que servem para casar os limites de palavras nas cadeias de caracteres. Nesse contexto da POSIX, uma palavra é formada por caracteres [:alnum:] ou traço baixo (_). Assim como as âncoras, esses metacaracteres não casam pedaços do texto, elas servem apenas como uma referência. Eles são: Perl e derivações Perl possui uma sintaxe mais consistente e rica que as normas POSIX BRE e ERE. Um exemplo é que \ sempre escapa um caractere não alfanumérico. Devido ao poder de expressão, outras ferramentas adotaram a sintaxe do Perl, como por exemplo Java, JavaScript, PCRE, Python, Ruby e .NET. Algumas linguagens e ferramentas como PHP suportam diversos tipos de expressões regulares. Um exemplo de funcionalidade possível em Perl mas não em POSIX é a quantificação preguiçosa. Os quantificadores padrões das expressões regulares são "gananciosos", isto é, casam o quanto puderem, voltando atrás somente se necessário para casar o resto da expressão regular. Por exemplo, um novato no assunto tentando encontrar a primeira instância de um item entre os símbolos < e > no texto "Outra explosão ocorreu em <26 de janeiro> de <2004>" provavelmente usaria o padrão <.*>, ou similar. Entretanto, esse padrão retornará "<26 de janeiro> de <2004>" ao invés de "<26 de janeiro>", como esperado, pois o quantificador * é ganancioso — ele consumirá a quantidade máxima de caracteres, e "26 de janeiro> de <2004" possui mais caracteres que "26 de janeiro". Apesar desse problema ser evitável de diferentes formas (por exemplo, especificando o que não casar: <[^>]*>), a maioria das ferramentas permitem que um quantificador seja preguiçoso, ou não ganancioso, ao suceder o quantificador com um ponto de interrogação. No exemplo anterior, a alternativa seria <.*?>. Seguem os quantificadores não gulosos: O PERL define algumas sequências de escape que servem como atalhos para certos metacaracteres: Além dos quantificadores preguiçosos e das novas sequências de escape, o Perl também adicionou uma forma nova de casamento de padrões que estendem a POSIX. São um conjunto de metacaracteres que seguem o padrão (?...), listados abaixo: Padrões para linguagens não regulares Diversas funcionalidades encontradas em bibliotecas atuais de expressões regulares provem um poder de expressão que excede as linguagens regulares. Por exemplo, a habilidade de agrupar subexpressões com parênteses e chamar novamente o valor casado na mesma expressão significa que o padrão pode casar cadeias de palavras repetidas como "papa" ou "WikiWiki", os chamados quadrados na teoria de linguagens formais. O padrão para essas cadeias é (.*)\1. Entretanto, a linguagem de quadrados não é regular, nem livre de contexto. Casamento de padrões com um número indeterminado de referências anteriores, como suportado em ferramentas atuais, é NP-difícil. Entretanto, as ferramentas que fornecem tais construções ainda usam o termo expressões regulares para os padrões, o que leva a uma nomenclatura que difere da teoria das linguagens formais. Por essa razão, algumas pessoas usam o termo regex ou simplesmente padrão para descrever esse conceito mais abrangente. Implementações Existem pelo menos dois algoritmos fundamentalmente diferentes entre si que decidem se e como uma expressão regular casa uma cadeia de caracteres. O mais antigo e mais rápido faz uso dum princípio da teoria de linguagens formais que permite a todas as máquinas de estado finito não determinísticas serem transformadas em máquinas de estado finito determinísticas. Geralmente chamado de DFA, o algoritmo realiza ou simula tal transformação e então executa a máquina determinística resultante na cadeia de caracteres, um símbolo de cada vez. Esse último processo tem complexidade linear relativa ao tamanho da cadeia de caracteres. Mais precisamente, uma cadeia de caracteres de tamanho n pode ser testada numa expressão regular de tamanho m no tempo O() ou O(), dependendo dos detalhes de implementação. Esse algoritmo é rápido, mas pode ser usado somente para casamentos e não para a nova chamada de grupos de captura, quantificação preguiçosa e diversas outras funcionalidades encontradas nas bibliotecas modernas de expressões regulares. Também é possível executar a máquina não determinística diretamente, construindo cada estado da máquina determinística quando necessário e então descartando-o no próximo passo. Isso evita a quantidade exponencial de memória necessária para a construção completa da máquina determinística, ainda que garantindo a busca em tempo linear. O outro algoritmo é casar o padrão com a cadeia de caracteres através de backtracking. Geralmente chamado de NFA, Seu tempo de execução pode ser exponencial, o que pode acontecer em implementações simples no casamento de expressões como (a|aa)*b, que forçam o algoritmo a considerar um número exponencial de subcasos. Implementações modernas geralmente identificam tais casos, e aceleram e abortam a execução. Apesar dessas implementações com backtracking garantirem tempo exponencial no pior caso, elas fornecem mais flexibilidade e poder de expressão. Relacionamento com Unicode Originalmente, as expressões regulares eram usadas com caracteres ASCII, mas várias implementações atuais suportam Unicode. Na maioria dos casos não há diferença entre conjuntos de caracteres, mas algumas questões são relevantes ao suportar Unicode. Uma delas é a codificação suportada, já que algumas implementações esperam UTF-8, enquanto outras podem esperar UTF-16 ou UTF-32. Outra questão é estender as funcionalidades disponíveis para ASCII no Unicode. Por exemplo, em implementações ASCII, conjuntos de caracteres na forma [x-y] são válidos para quaisquer x e y no intervalo [0x00,0x7F] desde que o código de x seja menor que o código de y. A escolha natural seria permitir o mesmo em Unicode no intervalo de códigos [0,0x10FFFF], o que não é possível pois algumas implementações não permitem que conjuntos de caracteres ultrapassem os blocos de código disponíveis. Do ponto de vista dos detalhes técnicos do Unicode, também surgem questões. Como a normalização, pois, em Unicode, mais de um código pode representar o mesmo caractere. Por exemplo, o caractere "é" pode ser representado por U+0065 (letra latina "e" minúsculo) combinado com U+0301 (diacrítico "acento agudo"), mas também pode ser representado como U+00E9 (letra latina "e" com diacrítico "acento agudo"). Também há os códigos de controle Unicode, as marcas de ordem de byte e as marcas de direção de texto, que devem ser tratados separadamente. Uso Expressões regulares são usadas por diversos editores de texto, utilitários e linguagens de programação para procurar e manipular texto baseado em padrões. Por exemplo, Perl e Tcl possuem suporte a expressões regulares nativamente. Diversos utilitários de distribuições Unix incluem o editor de texto ed, que popularizou o conceito de expressão regular, e o filtro grep. Outro uso é a validação de formatos de texto (validação de protocolos ou formatos digitais). Por exemplo, ao receber a entrada dum campo de formulário duma aplicação que supõe receber um endereço de email, pode-se usar uma expressão regular para garantir que o que foi recebido de fato é um endereço de email. Mais um uso é a implementação interna dum sistema de realce de sintaxe, como encontrado em ambientes de desenvolvimento integrado. Expressões regulares podem ser usadas para encontrar palavras reservadas, literais e outros tokens específicos, e para alterar a formatação do texto de acordo com o casamento feito. Um uso difundido de expressões regulares é a filtragem de informação em bancos de dados de texto. Por exemplo, num arquivo de texto contendo cadastros de pessoas e suas datas de aniversário como a seguir: 1954-10-01 João Alberto 1976-07-25 Maria Eduarda 1966-10-22 Carlos Silva Pode-se filtrar pessoas que nasceram num determinado ano, mês ou dia. Por exemplo, o uso do padrão ^[0-9]{4}-10-[0-9]{2} (.*)$ identifica o nome das pessoas que nasceram em outubro (mês 10). Para o cadastro acima seriam retornados dois grupos de captura, \1 contendo "João Alberto" e \2 contendo "Carlos Silva". Explorando o exemplo anterior e o uso de validação de formatos digitais, é possível usar expressões regulares para validar as datas presentes no arquivo de texto de aniversários acima. O padrão (19|20)\d\d([- /.])(0[1-9]|1[012])\2([012][0-9]|3[01]) é usado para validar uma data entre 1900-01-01 e 2099-12-31. Atentar que a separação entre ano, mês e dia pode se dar através de hífen, espaço em branco, barra ou ponto. Mas deve-se usar o mesmo símbolo de separação entre ano e mês e entre mês e dia, o que é possível através da nova chamada do grupo de captura anterior (o trecho \2 do padrão). Atentar também que o padrão é incompleto na medida em que não diferencia a quantidade de dias em cada mês, o que resulta no casamento de até "2000-02-31" (31 de fevereiro), incorreta de acordo com o calendário gregoriano. 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