द्वितीयक, या अप्रत्यक्ष, इम्यूनोफ्लोरेसेंस दो प्रतिरक्षियों का उपयोग करता है, पहला (प्राथमिक प्रतिरक्षी) जो लक्ष्य अणु को पहचानता है और उससे बंधता है और दूसरा (द्वितीयक प्रतिरक्षी), जो फ्लोरोफोरे को वहन करता है, प्राथमिक प्रतिरक्षी की पहचान करता है और उससे बंधता है। यह प्रोटोकॉल, उपरोक्त प्राथमिक (या प्रत्यक्ष) से अधिक जटिल है और इसमें अधिक समय लगता है लेकिन यह अधिक लचीलापन प्रदान करता है।

यह प्रोटोकॉल इसलिए संभव है क्योंकि एक प्रतिरक्षी में दो भाग होते हैं, एक परिवर्तनीय क्षेत्र (जो एंटीजेन को पहचानता है) और एक अपरिवर्तनीय क्षेत्र (जो प्रतिरक्षी अणु की संरचना करता है)। एक शोधकर्ता कई प्राथमिक प्रतिरक्षी उत्पन्न कर सकता है जो विभिन्न एंटीजनों की पहचान करता है (जिसमें विभिन्न परिवर्तनीय क्षेत्र है), लेकिन सभी एक ही अपरिवर्तनीय क्षेत्र को सांझा करते हैं। इसलिए यह सभी प्रतिरक्षी एक एकल द्वितीयक प्रतिरक्षी द्वारा पहचान लिए जाते हैं। यह प्राथमिक प्रतिरक्षी को प्रत्यक्ष रूप से एक फ्लोरोफोरे वहन करने के लिए संशोधित करने की लागत को बचाता है।

अपरिवर्तनीय क्षेत्रों वाले विभिन्न प्राथमिक प्रतिरक्षी आम तौर पर अलग-अलग प्रजातियों में प्रतिरक्षी को उगाने के द्वारा उत्पन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, एक शोधकर्ता एक बकरी में प्राथमिक प्रतिरक्षी पैदा कर सकता है जो कई एंटीजनों की पहचान करता है और तब डाई-युग्मित खरगोश की द्वितीयक प्रतिरक्षी को शामिल करता है जो बकरी की प्रतिरक्षी अपरिवर्तनीय क्षेत्र की पहचान करता है ("खरगोश गैर-बकरी" प्रतिरक्षी)। शोधकर्ता तब एक चूहे में प्राथमिक प्रतिरक्षी का एक दूसरा सेट तैयार करते हैं जिसे एक अलग "गधा गैर-चूहा" द्वितीयक प्रतिरक्षी द्वारा पहचाना जा सकता है। यह बनाने-में-मुश्किल डाई-युग्मित प्रतिरक्षियों के कई परीक्षणों में पुनः उपयोग को सम्भव बनाता हैं।

सीमाएं
इम्यूनोफ्लोरेसेंस के प्रकार
द्वितीयक (अप्रत्यक्ष)
प्राथमिक (प्रत्यक्ष)