क्रिस्टन स्टिवर्ट "अड्वेंचर" के सेट पर थीं जब हार्डविक उससे एक अनौपचारिक स्क्रीन टेस्ट के लिए मिले, जिसने निर्देशक को "मोहित" कर दिया। एडवर्ड कलन की भूमिका के लिए हार्डविक ने शुरू में रॉबर्ट पैटिनसन को नहीं चुना था, लेकिन स्टिवर्ट के साथ उसके घर पर एक ऑडिशन के बाद, वह चुना गया। अपने स्क्रीन टेस्ट से पहले पैटिनसन उपन्यास श्रृंखला से अपरिचित था, लेकिन बाद में उसने क़िताबों को पढ़ा. मेयेर ने उसे अधूरे "मिडनाइट सन" की पांडुलिपि देखने की अनुमति दी, जो "ट्वाइलाइट" को एडवर्ड के नज़रिए से घटनावार रखता है। एडवर्ड के रूप में पैटिनसन के चयन को शुरू में प्रशंसकों की नकारात्मक प्रतिक्रिया मिली; रेचेल लेफ़ेवर ने टिप्पणी की कि "हर औरत की कल्पना में उसका अपना एक एडवर्ड था, जिसे छोड़ना ज़रूरी था, ताकि वे उसे अपना सके, जो उन्होंने किया।" दो मुख्य पात्रों के चयन की प्रतिक्रिया में मेयेर "उत्साहित" और "आनंदित" थीं। निर्माण से पहले उसने, बेला और एडवर्ड के रूप में क्रमशः एमिली ब्राउनिंग और हेनरी केविल के चयन में रुचि व्यक्त की थी।

कार्लिसल कलन के रूप में मूलतः पीटर फ़ेसिनेल्ली को नहीं चुना गया था। "[हार्डविक ने] [उसे] पसंद किया, लेकिन एक और अभिनेता था, जिसका नाम स्टूडियो आगे बढ़ा रहा था।" अज्ञात कारणों से, वह कलाकार अभिनय करने में अक्षम था और फ़ेसिनेल्ली को उसके स्थान पर चुना गया। ऐलिस कलन के किरदार के लिए एश्ले ग्रीन का चुनाव कुछ हद तक प्रशंसकों की आलोचना का शिकार हुआ, कारण था उपन्यास में वर्णित अपने चरित्र से ग्रीन का लंबा क़द. मेयेर ने यह भी कहा कि रेचेल ले कुक उसकी कल्पना के ऐलिस से काफ़ी मिलती-जुलती है। निकी रीड इससे पहले हार्डविक के साथ "थर्टीन", जिसे उन्होंने संयुक्त रूप से लिखा था और "लॉर्ड्स ऑफ़ डॉगटाऊन" में काम कर चुकी थी। "मैं यह नहीं कहना चाहती कि यह एक संयोग है, क्योंकि हम संयुक्त रूप से अच्छा काम करते हैं और हमारा इतिहास शानदार है। मुझे लगता है कि हम साथ में अच्छा काम करते हैं, लेकिन अक्सर ऐसा होता है कि जो लोग [हार्डविक] अपनी फ़िल्म निर्देशित करने की पेशकश करते हैं, इस बात की संभावना ज़्यादा है कि उन्होंने उसके अन्य काम देखें हों.

केल्लन लुट्ज़ अफ़्रीका में HBO की लघु श्रृंखला "जनरेशन किल" के फ़िल्मांकन में व्यस्त थे, जब एम्मेट कलन के चरित्र के लिए परीक्षण आयोजित किए गए। दिसम्बर 2007 में निर्माण ख़त्म होने तक, भूमिका के लिए चयन हो चुका था, लेकिन जिस अभिनेता का चयन हुआ था वह "पीछे हट गया"; उसके तुंरत बाद लुट्ज़ ने परीक्षण दिया और ओरेगन पहुंच गया, जहां हार्डविक ने व्यक्तिगत तौर पर उसे चुना। रेचेल लेफ़ेवर फ़िल्म में एक भूमिका करने की इच्छुक थीं, क्योंकि हार्डविक एक निर्देशक के रूप में परियोजना से जुड़ी थीं और वहां "एक चरित्र को खंगालने की क्षमता थी, संभवतः, तीन फ़िल्मों में" और वह एक पिशाच का अभिनय करना चाहती थीं। "[उसने] सोचा कि पिशाच मूलतः मनुष्य की चिंता और जीवित होने के प्रश्नों के बारे में सबसे अच्छे रूपक थे।" क्रिश्चियन सेराटोस ने शुरू में जेसिका स्टैनले के किरदार के लिए परीक्षण दिया, लेकिन किताबें पढ़ने के बाद वह "एंजेला के प्रेम में उलझ गई" और सफलतापूर्वक बाद के एक मौक़े का फ़ायदा उठाते हुए एंजेला वेबर के लिए परीक्षण दिया। जेसिका स्टेनली की भूमिका एन्ना केंड्रिक के पास गई, जिसे यह भूमिका विभिन्न अभिनेताओं के साथ दो मिक्स-एंड-मैच परीक्षण के बाद मिली। 

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