आम तौर पर एक व्यक्ति को एक करवट में लिटा कर, सेरेब्रल तरल (CSF) एकत्र करने के लिये लोकल एनेस्थीसिया लगा कर और ड्यूरल सैक (रीढ़ की हड्डी के चारों ओर लगी थैली) में एक सुई डाल कर लंबर पंचर किया जाता है। जब यह प्राप्त हो जाता है तो मैनोमीटर का उपयोग करते हुये CSF का “खुलने वाला दाब” मापा जाता है। दाब आम तौर पर 6 और 18 cm जल (cmHO) के बीच होता है; बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर में दाब आम तौर पर बढ़ा होता है। In क्रिप्टोकॉकल मस्तिष्क ज्वर में अंतःकपालीय दाब काफी बढ़ा होता है। तरल का आरंभिक स्वरूप संक्रमण की प्रकृति का संकेत साबित हो सकता है: धुंधला CSF संकेत करता है कि प्रोटीन, सफेद व लाल रक्त कोशिकाओं और/या बैक्टीरिया का स्तर ऊंचा है और इसलिये इसमें बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर हो सकता है।
CSF नमूने का परीक्षण श्वेत रक्त कोशिकाओं, लाल रक्त कोशिकाओं, प्रोटीन मात्रा और ग्लूकोस स्तर की उपस्थिति व प्रकार के लिये किया जाता है। नमूने की ग्राम स्टेनिंग बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर में बैक्टीरिया प्रदर्शित कर सकता है, लेकिन बैक्टीरिया की अनुपस्थिति बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर की संभावना को निष्कासित नहीं करती है क्योंकि वे सिर्फ 60% मामलों में दिखते हैं; यदि नमूना लिये जाने के पहले एंटीबायोटिक्स दिये गये थे तो यह आंकड़ा 20% तक और कम हो जाता है। ग्राम स्टेनिंग भी लिस्टेरियोसिस जैसे संक्रमणों में कम विश्वसनीय है। माइक्रोबायोलॉजिकल कल्चर का नमूना अधिक संवेदनशील होता है (यह 70–85% मामलों में जीवों को पहचान लेता है) लेकिन परिणाम उपलब्ध होने में 48 घंटे तक का समय लगता है। रक्त कोशिकाओं का अधिक उपस्थित प्रकार (तालिका देखें) संकेत करता है कि क्या मस्तिष्क ज्वर बैक्टीरिया (आम तौर पर न्यूट्रोफिल-प्रीडॉमिनेंट) जनित है या वायरस (आमतौर पर लिम्फोसाइट-प्रीडॉमिनेंट) जनित, हलांकि रोग की शुरुआत में यह हमेशा विश्वसनीय संकेतक नहीं होता है। कम सामान्य मामलों में स्नोफिल प्रबलता दूसरे कारणों के साथ परजीवी या फंफूंद के कारण होने का सुझाव देती है।

CSF में ग्लूकोस की अधिकता आम तौर पर रक्त की तुलना में 40% ऊपर होती है। बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर में यह आम तौर पर कम होती है; CSF का ग्लूकोस स्तर इस कारण रक्त शर्करा (CSF ग्लूकोस सो सीरम ग्लूकोस अनुपात) से विभाजित किया जाता है। ≤0.4 का अनुपात बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर का संकेत हो सकता है; नवजात में CSF में ग्लूकोस का स्तर आम तौर पर उच्च रहता है और 0.6 (60%) के नीचे का अनुपात असामान्य माना जाता है। CSF में लैक्टेट बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर के होने की संभावना के उच्च स्तर को दर्शाता है, ठीक ऐसे ही श्वेत रक्त कोशिकाओं की उच्च संख्या भी। यदि लैक्टेट स्तर 35 mg/dl से कम हों और व्यक्ति ने पहले कोई ऐंटीबायोटिक न लिया हो तो यह बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर होने की संभावना क्षीण करता है।

मस्तिष्क ज्वरों के विभिन्न प्रकार की पृथक पहचान करने के लिये अन्य विशेष परीक्षण उपयोग किये जा सकते हैं। लैटेक्स एग्लुटिनेशन परीक्षण "स्ट्रैप्टोकॉकस न्यूमोनिया", "नीएसेरिया मेनिन्जाइटिडिस","हीमोफिलिज़ इन्फ्युएंज़ा", "एस्केरीशिया कॉलि"और "ग्रुप बी स्ट्रेप्टोकॉकि" के कारण होने वाले मस्तिष्क ज्वर में सकारात्मक हो सकता है; इसका नियमित प्रयोग प्रोत्साहित नहीं किया जाता है क्योंकि इसके कारण उपचार में परिवर्तन बहुत कम होते हैं लेकिन इसे तब उपयोग किया जा सकता है जब दूसरे परीक्षण निदान न कर पा रहे हों। इसी प्रकार लिम्युलस लाइसेट परीक्षण ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर में सकारात्मक हो सकता है, लेकिन यह तब तक सीमित रूप से उपयोगी होता है जब तक कि अन्य परीक्षण सहायक न रहे हो। पॉलीमरेस चेन रिएक्शन (PCR) एक ऐसी तकनीक है जो बैक्टीरिया के DNA के छोटे निशानों को बढ़ाने में उपयोग की जाती है, जिससे कि सेरेब्रोस्पाइनल तरल में बैक्टीरिया या वायरस DNA की उपस्थिति की पहचान की जा सके; यह एक उच्च संवेदनशीलता वाला तथा विशिष्ट परीक्षण है क्योंकि इसमें संक्रमित एजेंट के DNA के निशानों की राशि की जरूरत होती है। यह बैक्टीरिया जनित मस्तिष्क ज्वर में बैक्टीरिया की पहचान कर सकता है और वायरस जनित मस्तिष्क ज्वर (उनमे जिनको एंटेरोवायरस, हरपीस सिंप्लेक्स वायरस 2 और मम्स के लिये टीका न दिया गया हो) के विभिन्न मामलों में अंतर पता करने के लिये सहायक हो सकता है। सेरोलॉजी (वायरसों के एंटीबॉडी की पहचान) वायरस जनित मस्तिष्क ज्वर में उपयोगी हो सकता है। यदि ट्यूबरकलोस मस्तिष्क ज्वर का संदेह हो तो, नमूने को ज़ील नेल्सन स्टेनजिसकी संवेदनशीलता निम्न है और ट्यूबरकुलोसिस कल्चर, जिसमें अधिक समय लगता है; PCR का उपयोग बढ़ रहा है। CSF पर इंडियन इंक स्टेन का उपयोग करके क्रिप्टोकॉकल मस्तिष्क ज्वर का निदान कम लागत पर किया जा सकता है; हलांकि रक्त या CSF में क्रिप्टोकॉकल एंटीजन का परीक्षण अधिक संवेदनशील होता है विशेष रूप से AIDS पीड़ित लोगों में।

जहां पर एंटीबायोटिक्स लेने के बाद मस्तिष्क ज्वर के लक्षण होते हैं (जैसे कि प्रकल्पित साइनोसाइटिस), "आंशिक रूप से उपचारित मस्तिष्क ज्वर", एक निदानात्मक व उपचारात्मक कठिनाई है। जब ऐसा होता है तो CSF निष्कर्ष वायरस जनित मस्तिष्क ज्वर के समान दिख सकते हैं, लेकिन एंटीबायोटिक उपचार तब तक जारी रखने की आवश्यकता होती है जब तक कि वायरस संबंधी कारण (उदा. के लिये सकारात्मक एन्टेरोवायरस PCR) के निश्चित लक्षण बने रहते हैं।
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