पेनिसिलिन की रसायनिक संरचना का निर्धारण 1945 में डोरोथी क्रोफूट हॉजकिन ने किया। उसके बाद से पेनिसिलिन आज तक का सबसे व्यापक पैमाने पर प्रयोग किया जाने वाला एंटीबायोटिक बन चुका है एवं यह आज भी बहुत से ग्राम-पॉज़िटिव जीवाणु संक्रमण के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। ऑस्ट्रेकियाई होवार्ड फ्लोरे के नेतृत्व में तथा अर्न्स्ट बोरिस चेन एवं नॉर्मन हीटले सहित ऑक्सफोर्ड अनुसंधान वैज्ञानिकों के एक दल ने इस दवा के मास-प्रोडक्शन की एक विधि तैयार की। फ्लोरे एवं चेन ने 1945 का दवाओं के लिए मिला नोबल पुरस्कार फ्लेमिंग के साथ बांटा. द्वितीय विश्व युद्ध के बाद नागरिकों को यह दवा मुहैया कराने में ऑस्ट्रेलिया अव्वल देश था। एमआईटी (MIT) के रसायनज्ञ जॉन सी. शीहान ने 1950 के दशक के पूर्वार्द्ध में पेनिसिलिन एवं इसके कुछ समरूपों का पहला कुल संश्लेषण पूरा किया लेकिन उनके तरीके मास प्रोडक्शन के लिए उपयुक्त नहीं थे।

इस दवा के मास-प्रोडक्शन की चुनौती कठिन थी। 14 मार्च 1942 को स्ट्रेपटोकोकल सेप्टीसेमिया के लिए अमेरिका-निर्मित पेनिसिलिन से पहले रोगी का इलाज किया गया, जिसका निर्माण मर्क एंड कंपनी ने किया था. उस समय उत्पादित कुल आपूर्ति का आधा हिस्सा उस अकेले रोगी के इलाज के लिए इस्तेमाल किया गया। 1942 जून तक अमेरिका में केवल दस रोगियों के इलाज के लिए ही पेनिसिलिन उपलब्ध था। दुनिया भर में ढूंढने के बाद 1943 में पियोरिया, इलिनोयास बाज़ार में एक छोटा सा विलायती खरबूजा मिला, जिसमें सर्वश्रेष्ठ एवं उच्चतम गुणवत्ता वाले पेनिसिलिन थे। खरबूजे की खोज एवं पियोरिया, इलिनोयास के नॉर्दर्न रीजनल रिसर्च लेबोरेटरीज़ में मक्के में भीगी शराब के किण्वन शोध के परिणामों ने अमेरिका को 1944 की वसंत ऋतु में नौर्मेंदी के आक्रमण से लड़ने के लिए एकबारगी 2.3 मिलियन खुराक उत्पादित करने की अनुमति दे दी। केमिकल इंजीनियर मार्गरेट हचिन्सन रूसो द्वारा गहरी-टंकी किण्वन के विकास के कारण बड़े पैमाने पर उत्पादन शुरू हुआ।
जी.रेमंड रेट्यु ने पेनिसिलिन की वाणिज्यिक मात्रा उत्पादित करने के लिए अमेरिकी युद्ध स्तर की कोशिशों में अपने तकनीकों द्वारा योगदान दिया। 
द्वितीय विश्व युद्ध के दौरान पेनिसिलिन से मित्र देशों के मरने वालों एवं संक्रमित घावों की वजह से अंगविच्छेदन की संख्या में भारी अंतर पड़ा, जिससे अनुमानतः 12%-15% जानें बच गयीं। उपलब्धता बेहद कम थी, बहरहाल पेनिसिलिन की व्यापक मात्रा में निर्माण में कठिनाई एवं गुर्दे के इलाज में दवा के तेज़ी से लग जाने की वजह से शीघ्र ख़ुराक देने की आवश्यकता बढ़ गयी। पेनिसिलिन सक्रिय रूप से उत्सर्जित होता है एवं पेनिसिलिन ख़ुराक का तकरीबन 80% उसे देने से तीन या चार घंटे के भीतर ही शरीर से बाहर हो जाता है। वास्तव में प्रारम्भिक पेनिसिलिन युग के दौरान यह दवा इतनी दुर्लभ थी एवं इसकी कीमत इतनी ज़्यादा थी कि इलाज किये जा रहे रोगियों का मूत्र इकठ्ठा करना आम बन गया था, ताकि मूत्र में मौजूद पेनिसिलिन को अलग किया जा सके एवं उसे पुनः उपयोग में लाया जा सके। 

यह कोई संतोषजनक समाधान नहीं था, इसलिए शोधकर्ता पेनिसिलिन के उत्सर्जन की गति धीमी करने का तरीका ढूंढने लगे। उन्होंने एक ऐसा अणु ढूंढ निकालने की आशा जताई जो उत्सर्जन के लिए दायी कार्बनिक अम्ल परिवाहक के लिए पेनिसिलिन से मुक़ाबला कर सके, कुछ ऐसा ताकि परिवाहक अधिमानतः मुकाबला करने वाले अणुओं को उत्सर्जित करे एवं पेनिसिलिन बचा रहे। युरीकोसुरिक एजेंट प्रोबेनेसिड उपयुक्त साबित कर दिया गया। जब प्रोबेनेसिड एवं पेनिसिलिन एक साथ दिए जाते हैं, तो प्रोबेनेसिड पेनिसिलिन के उत्सर्जन को प्रतिस्पर्धात्मक रूप से रोकता है एवं पेनिसिलिन की एकाग्रता एवं दीर्घकालिक सक्रियता को बचा कर रखता है। अंततः, मास-प्रोडक्शन तकनीक एवं अर्द्ध-सिंथेटिक पेनिसिलिनों के आगमन ने आपूर्ति की समस्या का समाधान कर दिया, अतः प्रोबेनेसिड का यह उपयोग समाप्त हुआ। बहरहाल कुछ ऐसे संक्रमणों के लिए जिनमें ख़ास तौर पर पेनिसिलिन की उच्च एकाग्रता की आवश्यकता होती है, प्रोबेनेसिड आज भी उपयोगी है।

बड़े पैमाने पर उत्पादन
पेनिसिलिन से विकास
प्रतिकूल प्रभाव
उत्पादन