पेनिसिलिन की खोज का श्रेय 1928 में स्कॉटिश वैज्ञानिक एवं नोबल पुरस्कार विजेता अलेक्ज़ेंडर फ्लेमिंग को जाता है। उन्होंने दिखाया कि यदि "पेनिसिलियम नोटेटम" उपयुक्त सबस्ट्रेट में बढ़े, तो यह एंटीबायोटिक गुणों के साथ एक पदार्थ निःसृत करेगा, जिसे उन्होंने पेनिसिलिन करार दिया। इस आकस्मिक अवलोकन ने एंटीबायोटिक खोज के एक आधुनिक युग का सूत्रपात किया। एक दवा के रूप में प्रयोग होने के लिए पेनिसिलिन के विकास का श्रेय ऑस्ट्रेलियाई नोबल पुरस्कार विजेता हॉवर्ड वाल्टर फ्लोरे तथा जर्मन नोबल पुरस्कार विजेता अर्न्स्ट चेन एवं अंग्रेज़ जीव रसायनविज्ञानी नॉर्मन हीट्ले को जाता है।

हालांकि कई अन्य लोगों ने फ्लेमिंग से पहले "पेनिसिलियम" के जीवाणुगत प्रभाव की सूचना दी थी। मवाद वाले घाव को ठीक करने के एक साधन के रूप में नीले फफूंद के साथ रोटी का उपयोग (अनुमानतः पेनिसिलियम) मध्य युग से यूरोप में लोक दवा का मुख्य आधार था। पहली बार प्रकाशित सन्दर्भ जॉन टिंडाल द्वारा 1875 में रॉयल सोसायटी के प्रकाशन में मिलता है। अर्न्स्ट डचेसने ने 1897 में कागज़ पर इसे प्रलेखित किया, जो इंस्टीट्यूट पेस्टेयर द्वारा उनकी युवावस्था के कारण खारिज कर दिया गया। मार्च 2000 में, सैन जोस, कोस्टा रिका में स्थित सैन जुआन डे दियोस हॉस्पिटल के डॉक्टरों ने वैज्ञानिक कोस्टा रिकान तथा चिकित्सक क्लोडोमिरो (क्लोरिटो) पिकाडो ट्वाईट (1887-1944) की पांडुलिपियों को प्रकाशित किया। उन्होंने 1915 और 1927 के बीच पिकाडो के अवलोकनों को जीनस "पेनिसिलियम" के फफूंद पर दमनात्मक प्रभाव में सूचित किया। पिकाडो ने अपनी खोज से पेरिस अकैडमी ऑफ साइंसेस को रूबरू कराया, लेकिन इसे पेटेंट नहीं किया, जबकि उनके अन्वेषण फ्लेमिंग की खोज से वर्षों पहले शुरू हो चुके थे। जोसेफ लिस्टर 1871 में अपने कीटाणुहीन शल्यक्रिया के लिए पेनिसिलम के साथ प्रयोग कर रहे थे। उन्होंने पाया कि इसने रोगाणुओं को तो कमज़ोर कर दिया, लेकिन जीवाणु को छोड़ दिया।

फ्लेमिंग ने वर्णन किया कि पेनिसिलिन की उनके खोज की तिथि शुक्रवार की सुबह, 28 सितम्बर 1928 थी। यह एक आकस्मिक दुर्घटना थी: लंदन के सेंट मेरीज़ हॉस्पिटल (अब इम्पेरियल कॉलेज का एक हिस्सा) के तहखाने में स्थित अपनी प्रयोगशाला में फ्लेमिंग ने गौर किया कि "स्टेफ़ीलोकोकस" प्लेट कल्चर सहित जीवाणुओं वाले एक पात्र को उन्होंने गलती से खुला छोड़ दिया था, जो नीले-हरे सांचे से संदूषित हो गया था, जिसका विकास दृश्यमान था। उस सांचे के चारों ओर दमनकारी जीवाणुओं के विकास का एक मंडल तैयार हो रहा था। फ्लेमिंग ने यह निष्कर्ष निकाला कि वह सांचा एक पदार्थ निकाल रहा था जो इस विकास को रोक रहा था एवं जीवाणुओं को मार रहा था। उन्होंने एक शुद्ध कल्चर विकसित किया एवं पाया कि यह एक "पेनिसिलियम" सांचा था, जिसे अब "पेनिसिलियम नोटेटम" के रूप में जाना जाता है। यु.एस. (U.S.) डिपार्टमेंट ऑफ एग्रीकल्चर में एक अमेरिकी विशेषज्ञ की हैसियत से काम कर रहे चार्ल्स थॉम एक स्वीकृत जानकार थे एवं फ्लेमिंग ने यह मामला उन्हें भेजा. फ्लेमिंग ने "पेनिसिलियम" सांचे के शोरबे वाले कल्चर के निथारन का वर्णन करने के लिए "पेनिसिलिन" शब्द गढ़ा. इन प्रारंभिक चरणों तक में भी पेनिसिलिन ग्राम-पॉज़िटिव जीवाणुओं से लड़ने में काफी प्रभावी तथा ग्राम-निगेटिव अवयवों तथा फफूंदों से लड़ने में अप्रभावी पाया गया। उन्होंने प्रारंभिक आशा जताई कि पेनिसिलिन एक उपयोगी कीटाणुनाशक होगा, जो आज उपलब्ध रोगाणुरोधकों के मुकाबले न्यूनतम विषाक्तता के साथ बेहद शक्तिशाली होगा एवं ""बैसिलस इन्फ़्लुएन्ज़ा" " (अब "हैमोफिलस इन्फ़्लुएन्ज़ा") के प्रयोगशाला संबंधी महत्व का भी उल्लेख किया। आगामी प्रयोगों के बाद, फ्लेमिंग आश्वस्त हुए कि पेनिसिलिन रोगजनक जीवाणुओं को मारने के लिए मानव शरीर में अधिक देर तक नहीं टिक सकता, एवं 1931 के बाद उन्होंने इसका अध्ययन बंद कर दिया। उन्होंने 1934 में पुनः नैदानिक परीक्षण शुरू किया तथा 1940 तक इसकी शुद्धीकरण के लिए किसी उपयुक्त व्यक्ति की तलाश के कोशिश करते रहे। 

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