This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
Department of Physiology, UT Health Science Center, San Antonio
This article is a part ofJoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.Recommend JoVE to Your Librarian
Current Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
Semenov, I., Herlihy, J. T., Brenner, R. In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice. J. Vis. Exp. (64), e3703, doi:10.3791/3703 (2012).
Transgenik ve knockout farelerde havayolu 1,2 fizyolojisi ve patofizyolojisi soruşturma için güçlü araçlar olmuştur. Izole trakea preparatlarında in vitro tensometry olarak havayolu düz kas (ASM) genetiği değiştirilmiş farelerde kontraktil yanıt yararlı bir test olduğu kanıtlanmıştır. In vitro trakea preparatlarında Bu nispeten basit, sağlam bir yanıt sağlamak ve fonksiyonel kolinerjik sinir uçlarını ve kas yanıtları, hatta uzun inkubasyon sonrasında korurlar.
Trakeal tensometry da düz kas kasılması etkileyen ikincil haberci sinyal yolunun çeşitli çalışmak için işlevsel bir test sağlar. Trakeada daralma başta ASM (Şekil 1) üzerine asetilkolin serbest olduğunu parasempatik kolinerjik sinirler aracılığıyla olur. Büyük ASM asetilkolin reseptörlerini sırasıyla G i / o ve Gq reseptörler vardır muskarinik M2 ve M3 olan 3,6,7 gelen artış IP3 üretim ve IP3 aracılı kalsiyum salınımını aktive Gq için kaplin tarafından daralma çağrıştırıyor. M2 / G i / o sinyalizasyon cAMP düzeyleri 5,8,9,10 bir azalmaya yol adenilat siklaz inhibisyonu ile kasılmaları kazandırdığı düşünülmektedir. Bu yollar, hava yolu düz kas 11 sözde "farmakoekonomi daralma kaplin" oluşturmaktadır. Buna ek olarak, M2 reseptörleri ile kolinerjik sinyalleşme (ve M3 sinyal ile modüle) sırasıyla L-tipi, Gerilime-bağlı kalsiyum kanalları (Şekil 1) ve bu nedenle "eksitasyon-kasılması kuplaj" olarak adlandırılan kalsiyum girişini (aktive olan ASM depolarize yolları içerir ) 4,7. Havayollarındaki konstriksiyon kontrol sinyal yolları hakkında daha detaylı değerlendirme 4,12 bulunabilir. Yukarıdaki yolları fare ve diğer türler arasındaki korunacak görünür. Ancak, fare tracheas diğer türlerden farklı in Biraz sinyal yolları. En önemli histamin ve adenozin 13,14 ile kasılma cevapları, insan ve diğer türler 5,15 hem tanınmış ASM modülatörleri onların eksikliğidir.
Burada fare trakeal halkalar izolasyonu için protokoller ve kontraktil çıkışı in vitro ölçüm sunuyoruz. Dahil donanım konfigürasyonu açıklamaları vardır, trakea halkası izolasyonu ve kasılma ölçümleri. Örnekler voltaj bağımlı kalsiyum girişini etkinleştirmek için, yüksek potasyum sinirlerin uyarımı ve doğrudan ASM kas depolarizasyon kullanarak dolaylı kasılmaları çağrıştıran için verilmiştir (1. Yüksek K +, Şekil 1). Buna ek olarak, yöntemleri elektrik alanı stimülasyonu (2. EFS, Şekil 1) eksojen nörotransmiter kullanılarak ASM kas, ya doğrudan uyarılması banyosunda (3. Eksojen Ach, Şekil 1) ile tek başına uygulandığında sinirlerin uyarılara için sunulmuştur. Bu dsyaxibility ve hazırlama kolaylığı izole trakea halkası modeli havayolu düz kas kasılmasına yer çağlayanlar sinyal bir dizi için sağlam ve fonksiyonel testi vermektedir.
1. Ekipman
Bir daralma ölçüm cihazı temel bileşenler) Şekil 2A şematik olarak gösterilmiştir.
3. Yüksek Potasyum Stimülasyon
Aşağıdaki dengelenme, trakea yüksek potasyum PSS solüsyonu (67 mM KCl, Tablo I) ile iki kez meydan. Kasılması genellikle organ banyosu tamamen trakea dinlenmek için normal bir PSS ile birkaç kez yıkanır kararlı durum hangi zaman ulaşmak için 5-10 dakika gerekir. Potasyum kasılması, ikinci bir kez tekrarlanır ve tekrarlanabilir kasılmaları kadar üçüncü bir kez (gerekirse) elde edilir.
Trakea hazırlık elektrik alan stimülasyonu (EFS) izin veren iki dikdörtgen platin levhalar (elektrotları) arasında yer alır. EFS kasılma cevapları frekans ve gerilim bir fonksiyonudur. Aynı zamanda bu elektrot alanı ve aralarındaki mesafe gibi fiziksel parametreler tarafından etkilenir. Stimülatör gücü özellikleri de yüksek gerilim ve akım çıkışları da stimülatör maksimum ulaşabileceğiniz gibi yanıtları etkiler. Herhangi bir EFS sistemin özellikleri uyaran süreleri, frekansları, gerilimler ve darbe süreleri farklı olarak kas kasılmaları incelenerek tespit edilmelidir. Bizim deney düzeneği için, ~ 4 mm ile ayrılmış elektrotlar ve 44 V (0.5 ms baklagiller) ve 30 Hz uyarımı genliği tekrarlanabilir yakın maksimum kasılma cevapları elde etmek için en uygun bulduk.
5.. Daralma EvKolinerjik Stimülasyon tarafından oked
Eksojen olarak uygulanan bileşikler trakea yanıt kümülatif doz moda ilacın birden eklemelerle, ilgi ilacın tek bir dozunun ek ile değerlendirilir veya edilir. Trakea, bizim laboratuar rutin asetilkolin aksine, karbakol asetilkolinesteraz tarafından bozulmuş değildir, çünkü kolinerjik reseptörleri aktive karbakol kullanılır. Makul bir doz-yanıt aralığı 10 -8 10 -5 M karbakol etmektir. Log takılması bir Hill-tipi denklemi [karbakol]-kontraktil yanıt eğrisi kolinerjik 19 trakeal daralma hassasiyet ölçüsüdür EC 50 (yarı maksimal etkin konsantrasyon) bir tahmin sağlar. Bu karbakol'ün belirli bir dozda kümülatif doz yanıt eğrisinin bir parçası olarak değil, tek bir doz olarak biraz daha fazla cevap verecektir dikkati çekiyor.
6. Temsilcisi SonuçlarPotasyum, yüksek bir kontraktil tepkisi bir örneği Şekil 3A 'de gösterilmiştir. Daralma yaklaşık 10 dakika içinde maksimuma ulaşır, ancak daha sonra küçük bir düşüş gösterebilir. Yüksek potasyum erken yıkanma sırasında, kas çözüm hatlarında ısıtmasız PSS çözümün küçük hacimli geçici hazırlık perfuses sıra sıcaklık düşüşü nedeniyle daralma geçici bir artış gösterebilir. Bu ısıtmalı PSS rezervuar ve doku banyo bağlayan boru minimum ölü hacme sahip en aza indirilebilir, hem de nispeten hızlı bir şekilde çözüm alışverişi yaparak (genellikle biz ml / dk 100 çözümler pompa) olabilir. Her hazırlık kas kütlesi veya diseksiyon sırasında oluşan hasar farklılıklar nedeniyle kontraktil yanıt olarak bazı farklılıklar olacaktır. Şekil 3B yüksek potasyum ve karbakol ile meydan farklı kas kütlesi iki tracheas gösterir. Kolinerjik-uyarılmış kasılmaları farklı olmasına rağmen,y normalleşme sonra yüksek potasyum solüsyonu (Şekil 3C) ile yanıt benzer.
Şekil 4, tek doz (A) ve kümülatif bir artış (B) kullanılarak bir karbakol (kolinerjik) uyarılmış kasılması bir örneğini göstermektedir. Karbakol çözümler banyo doğrudan eklendi ve kabarmış gaz hızlı karıştırma yardımcı olur edilir. Tek doz (yani 1 uM, Şekil 4A) Buna ek fazlalaştı kümülatif doz-yanıt eğrisi (1 uM, Şekil 4B) sırasında eşdeğer konsantrasyon göre biraz daha büyük tepki var iyisidir. Şekil 4C kasılma gücünün bir komplo gösterir Şekil 4B verileri kullanarak karbakol konsantrasyonları bir fonksiyonu olarak. Karbakol'ün Etkileri 10 -5 M konsantrasyonda doyurabilecek. Kolinerjik agonistler kalsiyum salınımını mekanizmalar aracılığıyla kasılma başlatır rağmen, daralmanın önemli bir bileşeni de depolarizasyon aracılık ve birGerilime-bağlı kalsiyum kanalları 20 aktivasyonu.
Şekil 5A EFS-uyarılmış kasılmaların bir örnek gösteriyor. Tracheas kasılmalar bir plato (inset a1 bakınız) ulaşana kadar 0.5 milisaniye süresi, 40 Volt pulslar kullanılarak uyarılır. Stimülasyon sıklığında bir artış artan bir kasılma cevapları (frekans cevabı eğrisi Şekil 5B çizilir) neden olur. Elektrik alan stimülasyonu presinaptik sinirleri aktive ederek ağırlıklı olarak kasılmalar uyandırmak için gösterilmiştir. Bu botulinum toksini, trakea 21 EFS-uyarılmış kasılmaların çoğunluğu bloke nörotransmitter sürüm bir engelleyici etkisi ile kanıtlanır. Ayrıca, tetrodotoxin, bloklar Na + kanalları da sinir aktivitesini inhibe ettiğini ve EFS için trakeanın yanıt ortadan kaldırdığı bir ajan.
Şekil 1. T Diyagramıo bir izole trakea hazırlık sinyal yollarının büyük. Gösterilen bir trakeal düz kas hücresi innerve eden kolinerjik akson terminali. Önemli sinyal yolları IP3 reseptörleri (M3) ve cAMP azaltma (M2) yoluyla kalsiyum salınımına neden M3-ve M2-muskarinik asetilkolin reseptör aktivasyonu (mACHR) vardır. M2 reseptörleri (ve M3 reseptörleri bazı katkısı) de L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanalları ve kalsiyum girişini aktive kolinerjik-uyarılmış depolarizasyon neden olur. Yaygın kontraktil ajanlar ve bunların efektörlerinin 1 vardır. yüksek potasyum (düz kas hücresi ve kolinerjik akson depolarize), 2. elektrik alan stimülasyonu (EFS, kolinerjik akson depolarizes) ve 3. Böyle asetilkolin veya karbakol gibi kolinerjik ilaçların eksojen uygulaması (doğrudan muskarinik reseptörleri aktive eder).
Şekil 2. Trakeal kasılmaları ölçmek için kullanılan ekipman Diyagramı. A. kuvvet dönüştürücü, mikrometre ve doku banyo vida klemensleri üzerinden çubuklar destek üzerine monte edilir. Trakeal halka üst ve alt çubuklar üzerinde dişli. Diyagramda, organ banyosunda (kuvvet dönüştürücü üzerine trakea montaj sırasında, yani) hazırlanması altında konumlandırılmıştır. Daralma çalışmaları sırasında, organ banyosu hazırlanması yıkanmak için dikey olarak taşınır. Elektrik alan stimülasyonu alt çubuğun B. trakea tutma tel yanal monte edilmiş iki platin levha içerecek şekilde değiştirilir. Platin plakalar bir uyarıcı elektrik telleri ile birbirine bağlanmıştır.
Şekil 3. Yüksek potasyum örnekleri (67 mM) trakeanın kasılma cevapları. (A), yüksek potasyum yinelenen, tekrarlanabilir tepkilerini gösterir. (B), iki farklı tracheas of karbakol için kontraktil tepkisi örnekleri. Normalize zaman (C) B tracheas cevapları benzeryüksek potasyum yanıt d.
Şekil 4. Karbakol indüklenen kasılmaları örnekleri. (A), tek doz kullanılarak Karbakol indüklenen kasılmaları yıkanmaya izledi. A. trakea (C) B'den Tepe kasılmaları için (B) Örnek kümülatif doz-yanıt eğrisi karbakol konsantrasyonunun işlevi olarak çizilen.
Şekil 5. Elektrik alan stimülasyonu ile uyarılmış kasılmaları örnekleri. 0.5 ms darbe, 40 volt, ve çeşitli stimülasyon frekansları kullanarak trakea kasılması (A) Elektrik alan stimülasyonu olarak gösterilir. Ankastre 30 Hz'de zaman genişletilmiş kasılmasıdır. (B) A dan Tepe kasılmaları plotte vardırstimülasyonu frekansının bir fonksiyonu olarak d.
Normal PSS
|Tuz||Conc. (MM)||Miktarı (gram / 2 L)|
|NaCl||119||13.91|
|KCl||4.7||0.7|
|KH 2 PO 4||1.18||0.32|
|MgSO 4 x 7H 2 O||1.17||0.58|
|NaHCO 3||18||3.02|
|EDTA||0.026||0.5 M, 0.1 mL|
|Glikoz||11||3.96|
|Sakaroz||12.5||8.56|
|CaCI2||2||10 mM, 400 ml|
Yüksek K + PSS (NACl ve KCl ayarlamaları)
|Tuz||Conc. (MM)||Miktarı (gram / 2 L)|
|NaCl||56.7||6.628|
|KCl||67||9.991|
. PSS çözümleri için Tablo 1 Reçete Not:. Çözümler ultra saf su kalitesi ile, haftalık taze yapılır, ve büyüme kirlenmesini önlemek için 5 gün daha uzun süre buzdolabında saklanır.
Burada sunulan protokol yolu kas fonksiyonunu değerlendirmek için fizyolojik bir hazırlık sağlar. Biz genellikle aynı anda 3-4 organı banyo müstahzarları faaliyet Ancak, paketlenmiş sistemleri 8 preparatları (ADInstruments, Dünya Hassas Aletler ve Harvard Apparatus) kadar eş zamanlı ölçümler izin tedarikçileri bir dizi edinilebilir. Biz eşdeğer sonuçları ile kuvvet dönüştürücüler ve doku organ banyolarına bir dizi kullanmış olurlar. Ancak, elektrik alan stimülasyonu uyarıcı elektrotlar boyutu, elektrot plakalar arası uzaklık, ve elektrik alanı içinde hazırlık konumu arasında küçük farklılıklar dayalı bazı değişkenlik sağladığını bulabilirsiniz. Böylece, ekstra bakım mümkün olduğunca benzer bir şekilde alan elektrotlar yapmak için yapılmalıdır.
Izometrik kuvvet ölçümleri en önemli parametre biri kas kütlesini varyasyonlar telafi etmek için kasılmaları normalize konusu olduğu, veyafarklı hazırlıklarını arasındaki kas dokusunun sağlık. Bölümünde, farklılıklar aynı yaş ve aynı cinsten (dişi farelerde düşük trakea gerginlik üretmek için eğiliminde) hayvanları karşılaştırarak minimize edilebilir. Ayrıca, biz trakea ıslak veya kuru ağırlığı normalleşme fare trakeanın küçük boyutları nedeniyle muhtemelen yeterli hassasiyet, yoksun olduğunu bulduk. Daha ziyade, birden çok yüksek potasyum, kasılmaların kullanımı oldukça avantajlıdır. Yüksek potasyum kasılmaları iki amaca hizmet ediyor. Yüksek potasyum kasılma trakeal kas "uyandırmak" için görünür ve kasılmaları, deneysel zorlukları geçmeden önce tekrarlanabilir olmasını sağlar. Yüksek potasyum daralmanın da hazırlanmasında mevcut aktif kas kütlesi için doğru bir normalleşme görünmektedir. Böylece, deneysel gerilim ölçümleri genellikle yüksek potasyum kasılma normalize kuvvet olarak ifade edilir. Buna ek olarak, bir preparat kalitesi yüksek potasyum indüklenen anlaşma kullanılarak değerlendirilebiliriyon. 10 haftalık C57BL/6J erkek fareler 20 yüksek potasyum bağlı kasılma ± 3.8 mN (± standart sapma, n = 17 ortalama) var - Örneğin, biz 8 bulabilirsiniz. De bu aralığı (12 mN veya aşağıda iki standart sapma aşağıda) altında trakea hazırlık sözleşmeler, o zaman genellikle deney için kullanılan "hasarlı" ve olmayan olarak kabul edilir. Alternatif olarak, satüre kolinerjik maksimum gerilim gerilim normalizasyon kullanılabilir. Bu agonist duyarlılık değişiklikleri gözlemlemek için yararlıdır, ama bu etki maksimum kontraksiyon değişiklikleri kaçırabilirsiniz.
Yöntem, bir kolinerjik veya elektrik stimülasyonu ile kullanarak ya da daralma etkinleştirmek için sunuldu. Doku banyosuna kolinerjik uygulama doğrudan düz kas harekete geçirir. Buna karşılık, orta EFS stimülasyon frekansı (en çok 25 Hz) kasılma çoğunluğu sinir aktivasyonu ve neurotransmi serbest bırakılması ile olurtter 22. Böylece araştırmacı EFS stimulasyonla presinaptik / sinir-aracılı kasılma etkileyen ilaçlar araştırmak için fırsat vardır. Son olarak, bu tür çalışmaların 24, aynı zamanda izole trakea hazırlanmasında kasılma etkilemek mast hücreleri 23 ve epitel hücreleri gibi diğer hücre tipleri göstermektedir. Böylece, in vitro fare trakea hazırlık hava yolu düz kas kasılmalarını etkileyen hücre tiplerinin bir dizi için sağlam bir fonksiyonel ölçüm sağlar.
Özet olarak, in vitro trakea hazırlık farenin solunum fonksiyonlarını etkileyen genetik değişimler analizinde özellikle yararlı olmuştur. Bazı örnekler iyon kanalları 17,20,25,26, metabotropik reseptörler 27,28,29,30 gen tırnakları analizini içerir ve aşağı kaskadlar 31 sinyalizasyon. In vitro ve 32 ek olarak, antijen meydan fare sık astım çalışmaları için kullanılırtrakea hazırlık astım aşağıdaki gelişimi ensues kontraktilite değişiklikler için yararlı bir test sağlar.
Çıkar çatışması ilan etti.
Bu çalışma Önleme Yenilik Merkezi ve Havayolu Hastalıkları, NINDS hibe (NS052574), Tedavi gelen ve Astım Araştırma Sandler Programı bir hibe ile finanse edildi.
|Name||Company||Catalog Number||Comments|
|Analogue-Digital Converter||ADInstruments||PowerLab 4/35|
|Carbachol (Carbamoylcholine Chloride)||Sigma-Aldrich||C4832||10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C)|
|Charting Software||ADInstrtuments||LabChart|
|Heating Circulator||Haake||Mixer Mill MM400|
|Isometric Force Transducer||Kent Scientific||TRN001|
|Stimulator||Grass Technologies||S88 Dual Output Square Pulse Stimulator|
|Tissue Bath||WPI||47264|