Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR, bir florofor kullanarak bir DNA amplifikasyon reaksiyonunda her polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) döngüsünden sonra toplam ürün miktarını ölçmek için bir yöntemdir.Yöntem, dahili veya harici referans yöntemlerle test edilecek numunedeki spesifik DNA dizilerini ölçmek için kullanılır.Başlangıcından bu yana, floresan kantitatif PCR testleri laboratuvar öğretmenleri arasında giderek daha popüler hale geldi.
Floresan PCR ilkesi: İlk olarak TaqManPCR ve daha sonra Real-TimePCR olarak adlandırılan Floresan PCR, 1995 yılında ABD'de PE (PerkinElmer) tarafından geliştirilen yeni bir nükleik asit niceleme tekniğidir. Teknik, floresan olarak etiketlenmiş bir probun veya ilgili kantitatif işlevini elde etmek için geleneksel PCR'ye floresan boya.Prensip: PCR reaksiyonu ilerledikçe, PCR reaksiyon ürünleri birikir ve floresan sinyalinin yoğunluğu eşit oranda artar.Her döngüde, ürün miktarındaki değişikliği floresan yoğunluğundaki değişiklikle izleyebilmemiz ve böylece bir floresan amplifikasyon eğrisi grafiği elde edebilmemiz için bir floresan yoğunluğu sinyali toplanır.
Genel olarak, floresan amplifikasyon eğrisi üç faza ayrılabilir: floresan arka plan sinyal fazı, floresan sinyal üssel amplifikasyon fazı ve plato fazı.Arka plan sinyali aşaması sırasında, güçlendirilmiş floresan sinyali, floresan arka plan sinyali tarafından maskelenir ve ürün miktarındaki değişiklikler belirlenemez.Plato aşamasında, amplifikasyon ürünü artık üssel olarak artmaz, son ürün miktarı ile başlangıç şablon miktarı arasında doğrusal bir ilişki yoktur ve son PCR ürün miktarına göre başlangıç DNA kopya sayısı hesaplanamaz.Yalnızca floresan sinyalinin üstel amplifikasyon aşamasında, PCR ürün miktarının logaritması ile başlangıç şablon miktarı arasında doğrusal bir ilişki vardır ve bu aşamada bunu nicelleştirmeyi seçebiliriz.Niceleme ve karşılaştırma kolaylığı için, gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR tekniğine iki çok önemli kavram eklenmiştir: floresan eşiği ve CT değeri.
Eşik, floresan amplifikasyon eğrisinde yapay olarak ayarlanmış bir değerdir.PCR amplifikasyonunun üstel fazı.
Ct değeri: Her bir reaksiyon tüpündeki floresan sinyalinin ayarlanan alan değerine ulaşmak için geçirdiği döngü sayısıdır.
Ct değeri ile başlangıç şablonu arasındaki ilişki: çalışmalar, her şablonun Ct değerinin, o şablonun başlangıç kopya sayısının logaritması ile doğrusal bir ilişkiye sahip olduğunu göstermiştir, başlangıç kopya numarası ne kadar çok kopya olursa, Ct o kadar küçük olur. değer.Ct değerleri nispeten kararlıdır.Aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi yatay koordinatın başlangıç kopya numarasının logaritmasını temsil ettiği ve dikey koordinatın Ct değerini temsil ettiği, bilinen bir başlangıç kopya numarasına sahip bir standart kullanılarak standart bir eğri yapılabilir.
Bu nedenle, bilinmeyen bir örneğin Ct değeri elde edilerek, o örneğin başlangıç kopya sayısı standart eğriden hesaplanabilir.
Ct değeri sabit değildir ve farklı numunelerden ve farklı cihazlardan etkilenebilir, aynı numune aynı cihazda 2 kez tekrarlansa bile Ct değeri değişebilir.
Nicel floresan deneyleri: Niceliksel floresan deneyleri, kullanılan belirteçlere bağlı olarak floresan problar ve floresan boyalar olarak ayrılabilir.Floresan problar şunları içerir: Beacon teknolojisi (Amerikan Tagyi ile temsil edilen moleküler işaret teknolojisi), TaqMan probları (ABI tarafından temsil edilir) ve FRET teknolojisi (Roche tarafından temsil edilir);floresan boyalar, doymuş floresan boyaları ve doymamış floresan boyaları içerir; doymamış floresan boyaların tipik temsilcisi, şu anda yaygın olarak kullanılan SYBRGreen I'dir;doymuş Doymamış floresan boyaların tipik temsilcisi SYBRGreenⅠ'dir;doymuş floresan boyalar EvaGreen, LCGreen, vb.'dir.
SYBRGreenI, çift sarmallı DNA'ya spesifik olmayan bir şekilde bağlanan floresan PCR için yaygın olarak kullanılan bir DNA bağlayıcı boyadır.Serbest durumda, SYBRGreenI zayıf bir flüoresans yayar, ancak bir kez çift sarmallı DNA'ya bağlandığında flüoresansı 1000 kat artar.Bu nedenle, bir reaksiyon tarafından yayılan toplam floresan sinyali, mevcut çift sarmallı DNA miktarı ile orantılıdır ve amplifikasyon ürünü arttıkça artar.
Çift sarmallı DNA bağlayıcı boyaların avantajları: basit deneysel tasarım, sadece 2 primer gerekli, prob tasarlamaya gerek yok, birden fazla genin hızlı testi için birden fazla prob tasarlamaya gerek yok, erime noktası eğrisi analizi yapabilme yeteneği, özgüllüğünü test etme amplifikasyon reaksiyonu, düşük başlangıç maliyeti, iyi genellik ve bu nedenle yurtiçi ve yurtdışındaki araştırmalarda daha yaygın olarak kullanılır.
Floresan prob yöntemi (Taqman tekniği): PCR amplifikasyonu gerçekleştirildiğinde, spesifik bir floresan prob ile birlikte bir çift primer eklenir.Prob sağlam olduğunda, raportör grup tarafından yayılan floresan sinyali söndürülmüş grup tarafından emilir ve PCR cihazı tarafından saptanmaz;PCR amplifikasyonu sırasında (uzatma aşamasında), Taq enziminin 5'-3' klevaj aktivitesi, probu enzimatik olarak bozar, raportör floresan grubu ve söndürülmüş floresan grubu yapar
Floresan kantitatif PCR uygulamaları.
Moleküler biyoloji araştırması:
1. Kantitatif nükleik asit analizi.Enfeksiyöz hastalıkların nicel ve nitel analizi, son influenza A (H1N1) salgını gibi patojenik mikroorganizmaların veya virüslerin tespiti, transgenik bitki ve hayvanların gen kopya sayılarının tespiti, RNAi gen inaktivasyon oranlarının tespiti, vb.
2. Diferansiyel gen ekspresyon analizi.Muamele edilen numuneler arasındaki gen ekspresyon farklılıklarının karşılaştırılması (örneğin ilaç tedavisi, fiziksel tedavi, kimyasal tedavi, vb.), farklı fazlarda spesifik genlerin ekspresyon farklılıkları ve cDNA mikrodizisinin veya diferansiyel ekspresyon sonuçlarının doğrulanması
3. SNP algılama.Tek nükleotid polimorfizmlerinin tespiti, farklı hastalıklara karşı bireysel duyarlılığın veya spesifik ilaçlara bireysel tepkinin incelenmesi için önemlidir ve moleküler işaretlerin ustaca yapısı nedeniyle, bir SNP'nin dizi bilgisi bilindiğinde, kolay ve doğrudur. yüksek verimli SNP tespiti için bu tekniği kullanın.
4. Metilasyon tespiti.Metilasyon, başta kanser olmak üzere birçok insan hastalığı ile ilişkilidir ve Laird, metillenmiş ve metillenmemiş DNA arasında ayrım yapmak için spesifik primerler ve Taqman probları kullanarak metillenmemiş sitozinin urasil hale gelmesi ve metillenmiş sitozinin etkilenmemesi için DNA'yı amplifikasyondan önce tedavi eden Methylight adlı bir teknik rapor etmiştir. .çok hassas.
Tıbbi araştırma:
1. Prenatal tanı: İnsanlar, genetik materyalin değişmesinden kaynaklanan kalıtsal hastalıkları tedavi edemezler ve şimdiye kadar, çeşitli kalıtsal hastalıkların ortaya çıkmasını önlemek için doğum öncesi izleme yoluyla doğan hasta bebeklerin sayısını azaltabilirler.Bu, hamile kadınlar tarafından kolayca kabul edilen non-invaziv bir yöntemdir.
2. Patojen tespiti: Floresan kantitatif PCR testi, gonokok, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, insan papilloma virüsü, herpes simpleks virüsü, insan immün yetmezlik virüsü, hepatit virüsü, influenza virüsü, Mycobacterium tuberculosis, EBV ve sitomegalovirüs gibi patojenlerin kantitatif olarak belirlenmesini sağlar.Geleneksel test yöntemlerine kıyasla yüksek hassasiyet, düşük örnek boyutu, hızlılık ve basitlik avantajlarına sahiptir.
3. İlaç etkililik değerlendirmesi: hepatit B virüsü (HBV) ve hepatit C virüsünün (HCV) kantitatif analizi, viral yük ile belirli ilaçların etkinliği arasındaki ilişkiyi gösterir.Lamivudin tedavisi sırasında serum HBV-DNA seviyesinin düşmesi ve ardından tekrar yükselmesi veya önceki seviyenin üzerine çıkması virüs mutasyonunun göstergesidir.
4. Onkogenetik test: Tümör gelişiminin mekanizması henüz netlik kazanmasa da, ilgili genlerdeki mutasyonların onkojenik transformasyonun altında yatan neden olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir.Onkogenlerin artan ekspresyonu ve mutasyonu birçok tümörün erken evrelerinde görülebilir.Gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR sadece genlerdeki mutasyonları tespit etmede etkili olmakla kalmaz, aynı zamanda onkogenlerin ekspresyonunu da doğru bir şekilde tespit edebilir.Bu yöntem, telomeraz hTERT geni, kronik granülositik lösemi WT1 geni, onkojenik ER geni, prostat kanseri PSM geni ve tümörle ilişkili viral genler dahil olmak üzere çeşitli genlerin ekspresyonunu saptamak için kullanılmıştır.
www.DeepL.com/Translator ile çevrilmiştir (ücretsiz sürüm)
Gönderim zamanı: Haziran-21-2022