Imunohistohemija
<s>Imunohistohemija (IHH) je metoda u laboratorijskoj dijagnostici koja se, koristeći osnovni princip u imunologiji da se određeno antitelo veže i prepoznaje samo ciljni antigen, bavi primenom obeleženih antitela kao specifičnih reagenasa za lokalizaciju i detekciju tkivnih konstituenata.</s><s>Ukoliko se govori o lokalizaciji proteina u ili na ćeliji onda govorimo o metodi imunocitohemije.</s>

<s>Poslednjih godina imunohistohemija se razvila u snažno dijagnostičko sredstvo koje pruža dodatne informacije prilikom rutinske morfološke analize tkiva, jer „ omogućava vizuelizaciju definisanih antigena u tkivnim presecima, vezivanjem antitela za male, specifične regione antigena tzv. epitope.“ Primena imunohistohemije u proceni odgovarajućih ćelijskih markera koji definišu specifični fenotip, omogućila je dobijanje važnih dijagnostičkih, prognostičkih i prediktivnih informacija neophodnih za klasifikovanje i diferenciranje pojedinih bolesti.</s><s>Osim u dijagnostičke, metode imunohistohemija se koristi i u naučno-istraživačke svrhe kako bi se bolje razumela distribucija i lokalizacija biomarkera i ekspresija pojedinih proteina u različitim tkivima.</s>

<s>Upotreba antitela na fiksiranom tkivu, da bi se izučavala patologija tkiva, zahtevala je određena prilagođavanja i usklađivanje imunohistohemijskih tehnika.</s><s>Budući da je očuvanost antigena u fiksiranom tkivu varijabilna kroz istoriju su se imunohistohemijske tehnike unapređivale kako bi se povećala osetljivost analize.</s><s>Specifični molekularni markeri su karakteristika pojedinih aktivnih događaja, kao što su proliferacija ćelija ili ćelijska smrt (apoptoza).</s>

<s>Vizuelizacija antitela i intereakcija sa antigenom može se postići na više načina.</s><s>Najjednostavniji primer; antitelo se konjuguje enzimom, kao što je peroksidaza, koji može ubrzati proces bojenja i proizvesti reakciju (vidi mrlje imunoperokidaze na slici).</s><s>Alternativno, antitela mogu biti označena i fluorescentnim jedinjenjima, kao što fluorescein ili rodamin (vidi imunofluorescencija).</s><s>Imunohistohemijska bojenja se široko primenjuju u dijagnostici oštećenja ćelija, kao što su ona koja se javljaju u kancerogenim tumorima.</s>

<s>Principi 
Ćelija je funkcionalna jedinica svih živih tkiva u kojoj se obavljaju osnovne životne funkcije organizma.</s><s>Procesi u kojima ćelije stiču specijalizovanu građu i funkciju naziva se diferencijacija.</s><s>Svetlosnim mikroskopom uočava se da ćelije stvaraju jezgro i citoplazmu, a elektronskim mikroskopom uočavaju se razne ćelijske organele.</s><s>Ono što ove dve metode ne mogu može imunohistohemijska tehnika koja omogućava lokalizaciju specifičnih antigena u tkivu ili u ćelijama zasnovanu na prepoznavanju antigena i antitela i omogućava vizuelizaciju tog kompleksa na mikroskopskom nivou.</s><s>Imunohistohemija u svom radu primenjuje obeležena antitela kao specifične reagenase za određivanje lokalizacije i otkrivanje (vizuelizaciju) tkivnih konstituenata (antigena) u preparatu in situ.</s>

<s>Imunohistohemija (IHH) je savremena metoda u medicinskoj dijagnostici u kojoj se zahvaljujući primeni imunoloških principa postigao veliki napredak u dijagnostici mnogih bolesti a posebno u patohistološkoj dijagnostici i istraživanju sve učestalijih tumora.</s>

<s>Kako se imunoglobulini i antigeni mikroskopski ne mogu videti mesto nastalog imunokompleksa postaje vidljivo uz pomoć enzima koji oksidira hromogen u prisustvu odgovarajućeg supstrata.</s><s>Kako bi ova metoda u praksi imala potpunu i pouzdanu primenu i značaj u dijagnostici u radu sa njom je potrebno poznavati metodologiju, a u dijagnostici interpretaciju imunohistohemijskih nalaza pri identifikaciji različitih antigena, intermedijarnih filamenata, hormonskih receptora, funkcionalnih proteina, onkofetalnih antigena i genskih produkata.</s>

<s>Dva osnovna načina prikazivanja nastalog imunokompleksa su imunoenzimska reakcija i obeležavanje antitela florescentnom materijom.</s>

<s>Direktna imunohistohemija</s>

<s>Najstarija metoda u imunohistohemiji je direktna imunohistohemija, koja se zasniva na reakciji specifičnog vezivanja antitela direktno na detektovanu supstancu (vidi sliku).</s><s>Godine 1940.</s><s>Kons je na rezu smrznutog tkiva otkrio određene antigene primenom antitela obeleženog fluoresceinom.</s><s>Antitela se mogu obeležiti radioaktivnim materijalom ili fluorescentnom bojom (npr. fluorizocijanatom ili rodaminom), koji emituju svetlo veće talasne dužine.</s><s>Nakon bojenja imunofulorescentnom bojom da bi se nastale promene mogle uočiti potreban je fluorescentni mikroskop sa živinom lampom i odgovarajućim vrstama filtera.</s><s>Loše strane imunofluorescentne tehnike su; visoka cena florescentnog mikroskopa, otežana morfološka analiza i autofluorescencija fiksiranog tkiva, 
 Dobre strane imunofluorescentne tehnike su; jednostavnost primene i dobra rezolucija pozitivnog nalaza kao zrnastog, linearnog, glatkog ili vlaknastog depozita.</s>

<s>Indirektna imunohistohemija</s>

<s>S kraja 20. veka razvila se i započela široka primena u hirurškoj patologiji, mnogo osetljivija metoda, indirektna imunohistohemija, zahvaljujući ranijem otkriću enzimskog obeležavanja antitela koja uz odgovarajući sistem hromogena i supstrata omogućava vizuelizaciju imunih kompleksa svetlosnim mikroskopom.</s><s>Enzim deluje na supstrat oslobađanjem jona koji oksidira rastvorljivi bezbojni hromogen u obojeni talog na mestu imunokompleksa.</s><s>Osetljivost metode povećavala se od antitela obeleženog enzimom preko višestepene detekcije sistemima peroksidaza-antiperoksidaza, konjugata avidin-biotina i biotin-streptavidina do amplifikacije tiramidom i vrlo osetljivih obeležavajućih sistema koji se zasnivaju na polimeru.</s><s>Nakon otkrića hibridomske tehnike, koja je uticala na obimnu industrijsku proizvodnju visoko specifičnih monoklonalnih antitela i iznalaženje mogućnosti upotrebe IHH na rutinski obrađenom i uklopljenom tkivu, dogodili su se ključni pomaci u primeni ovih metoda</s>

<s>Dvostruko imunohistohemijsko bojenje</s>

<s>Primena dvostrukog imunohistohemijskog bojenje omogućava istovremeno otkrivanje više različitih
antigena na istom preparatu.</s><s>U ovoj metodi primenjuje se dva ili više različitih antitela koja su u direktnoj imunohistohemiji obeležena različitim fluorescentnim materijama, a u indirektnoj imunohistohemiji vidljiva uz pomoć različitih enzimskih detekcijskih sistema.</s>

<s>Za izvođenje metode bitna je postupnost, pa se tek nakon potpunog dovršavanja tih reakcija i blokiranja prve reakcije pristupa narednoj.</s>

<s>Antigeni</s>

<s>Antigeni su supstance koje u organizmu pokreću stvaranje imunoglobulina tzv. antitela.</s><s>Antigeni su uglavnom proteini, a ređe ugljeni hidrati.</s><s>Razna molekularna mesta na antigenima zovu se epitopi–ili delovi antigena koje prepoznaju receptori na T i B limfocitima.</s><s>Determinanta ili epitop je deo makromolekula koji prepoznaje antitelo.</s><s>Deo jednog antitela koja prepoznaje epitope zove se paratop.</s><s>Makromolekuli sadrže veći broj epitop, od kojih se neki mogu ponavljati, a broj multiplih identičnih determinanti određuje valentnost antigena.</s><s>Epitop mogu biti nepreklapajući, kada su prostorno udaljeni i omogućavaju vezivanje dva ili više antitela.</s><s>Preklapajuće determinante su blizu jedna drugoj i dovode do sternih smetnji prilikom vezivanja antitela, a u retkim slučajevima je moguće i da vezivanje prvog antitela dovede do konformacione promene strukture antigena čime se utiče na vezivanje drugog antitela.</s><s>Epitop ugljenih hidrata i fosfolipida su kovalentne strukture.</s>

<s>Monoklonska antitela reaguju sa jednim, a poliklonska sa više epitopa na molekulu antigena.</s><s>Antigen i antitelo vezuju se hidrofobnim, jonskim ili Van der Valsov-im silama i tako stvaraju imunokompleks antigen-antitelo.</s>

<s>Antigeni i imunoglobulini-antitela se klasičnom mikroskopijom ne mogu videti, i zato mesto nastalog imunokompleksa postaje vidljivo uz pomoću enzima koji oksidira hromogen u prisustvu odgovarajućeg supstrata.</s>

<s>Antitela 
Za svaku imunohistohemijski tehniku najvažniji reagens je antitelo.</s><s>Antitela se nazivaju imunoglobulini (Ig) koji spadaju u grupu proteina a prisutni su u krvi imunizovanih životinja.</s>

<s>Imunoglobulini su građeni od:
 Dva istovetna teška lanca (H).</s><s>Teški lanci se razlikuju u antigenim i strukturnim karakteristikama i određuju klasu odnosno podklasu molekula imunoglobulina.</s><s>Dva laka lanca (L).</s><s>Laki lanci su ili tipa kapa (κ) ili lambda (λ).</s><s>Idući od onih kojih ima u najvećoj količini prema onima kojih ima najmanje, u krvi nalazimo pet vrsta (klasa) imunoglobulina: IgG, IgA, IgM, IgD i IgE.</s>

<s>Distribucija (κ) i (λ) lanaca razlikuje se između različitih životinjskih vrsta kao i kod svih imunoglobulinskih klasa i podklasa Lanci su međusobno povezani kovalnetnim disulfidnim
mostovima (L lanci sa H i H lanac sa H lancem), što dopunski povećava stabilnost
molekula imunoglobulina i same tercijarne strukture proteina.</s>

<s>Od pet klasa imunoglobulina u imunohistohemijskim analizama najzastupljeniji su i najčešće se koriste IgG i IgM.</s><s>Poliklonska antitela nastaju imunizacijom životinje jednim antigenom.</s><s>Ona prepoznaju više različitih epitopa istovetnog antigena.</s><s>U antiseruma imunizovane životinje pored antitela na taj antigen postoje nespecifična antitela koja treba ukloniti jer reaguju sa tkivnim antigenima i uzrokuju nespecifično bojenje pozadine.</s><s>Monoklonska antitela nastaju iz hibridoma, ćelije nastale spajanjem mišje ili zečje plazmocitomske ćelije i B limfocita iz slezine imunizovane životinje iste vrste.</s><s>Iz mnogobrojnih hiridomskih klonova izoluje se klon koji produkuje traženo specifično antitelo i odrasta u kulturi ćelija ili ascitesu.</s><s>Ćelije jednog klona proizvode čisto, monospecifično antitelo koje prepoznaje samo jedan epitop nekog antigena.</s><s>Monoklonska antitela su manje osetljiva, ali zato specifičnija od poliklonskih.</s><s>Zato je za uspostavljanje reproduktabilnosti metode potrebna u svakom bojenju pozitivna kontrola kao potvrda da su svi reagensi pravilno upotrebljni.</s>

<s>Primena imunohistohemije</s>

<s>Imunohistohemijske metode i tehnike 
Imunohistohemijske metode zasnivaju se na analizi:
 rutinski obrađenih, u parafin uklopljenih, uzorkovanih preseka tkiva
 krio isečaka - nativnih trenutno zamrznutih delova tkiva
 ćelijskih razmaza odnosno suspenzije</s>

<s>Imunohistohemijske tehnike međusobno se razlikuju prema:
 Primenljivosti određene tehnike na parafinske ili na nativne (krio.zamrznute) isečke.</s><s>Broju primenjenih slojeva antitela.</s><s>Obeleživaču poslednjeg sloja.</s><s>Po tome da li je primarni sloj monoklonski ili poliklonski.</s>

<s>Izvori 
 Novaković Z, Katić-Radivojević S, Todorović V. Primena imunohistohemijskih metoda u dijagnostici sarkocistioze goveda.</s><s>Veterinarski glasnik.</s><s>2006; 60(3-4):175-186.</s><s>Osborn, M., Isenberg, S. (1998) Immunocytochemistry of frozen and of paraffin tissue sections. u: Cells J.E. (ur.) Cell Biology, San Diego, California: Academic Press, 2. str. 486–492
 Shi, S., Cote, R.J., Young, L.L., Taylor, C.R. (1997) Antigen retrieval immunohistochemistry: Practice and development.</s><s>Journal of Histotechnology, 20(2): 145-154
 Immunocytochemistry Methods and Protocols.</s><s>Edited by Lorette C. Javois, 2nd edition, 1999.</s><s>Human Press.</s><s>Immunofluorescence Labeling of Cells (Sigma-Aldrich)
 Stephen B. Howell Lab Protocol – Immunocytochemistry 
 Spector Lab Protocol - Immunofluorescence Technique.</s><s>Immunofluorescence on Cultured Cells (University of London)  
 The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies - (11th Edition)
 Beesley, J.E. (1989) Colloidal gold: A new perspective for cytochemical marking.</s><s>Royal Microscopy Handbook #17.</s><s>Oxford Univ.</s><s>Press. pp 48.</s><s>Blose, S.H. & Feramisco, J.R. (1983) Fluorescent methods in the analysis of cell structure.</s><s>Cold Spring Harbour Laboratory.</s><s>Fujiwara, K. & Pollard, T.D. (1976) Fluorescent antibody localization of myosin in the cytoplasm, cleavage furrow, and mitotic spindle of human cells.</s><s>J. Cell Biol.</s><s>71, 848-875.</s><s>McBeath, E. & Fujiwara, K. (1984) Improved fixation for immunofluorescence microscopy using light-activated 1,3,5-triazido-2,4,6-trinitrobenzene (TTB).</s><s>J. Cell Biol.</s><s>99, 2061-2073.</s><s>Richman, D.D., Cleveland, P.H., Oxman, M.N., & Johnson, K.M. (1982) The binding of Staphylococcal protein A by the sera of different animal species.</s><s>J. Immunol.</s><s>128, 2300-2305.</s><s>Savage, M.D., Mattson, G., Desai, S., Nielander, G.W., Morgensen, S., & Conklin, E.J. (1992) Avidin-Biotin Chemistry: A handbook.</s><s>Pierce Chemical Company. pp 467.</s><s>Wang, K., Feramisco, J., & Ash, J. (1982) Fluorescent localization of contractile proteins in tissue culture cells.</s><s>In: Methods in Enzymology 85, 514-562.</s>

<s>Spoljašnje veze 
 Overview of Immunohistochemistry--describes all aspects of IHC including sample prep, staining and troubleshooting
 Yale Core Tissue Microarray Facility
 Histochemical Staining Methods - University of Rochester Department of Pathology
 Immunohistochemistry Staining Protocol</s>

<s>Histologija
Imunologija</s>

