Hibridizacija nukleinskih kiselina
<s>U molekulskoj biologiji, hibridizacija  je fenomen u kojem se jednostruki polulanci molekula dezoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili ribonukleinske kiseline (RNK) različitog porijekla međusobno ostvaruju komplementarne veze, stvarajući kombiniranu DNK ili RNK- Iako je dvostruka DNK sekvenca, u  fiziološkim uvjetima, uglavnom stabila, promjena uvjeta u laboratoriji (uglavnom podizanjem temperature okoline) će uzrokovati da se molekule rastaviti na jednostruke niti.</s><s>Te niti su, naravno,  komplementarne jedna drugoj, ali mogu biti komplementarne i za druge sekvence koje su prisutne u njihovom u okruženju.</s><s>Spuštanje okolne temperature omogućuje molekulama jednostrukih lanaca da se komplementarno  "ukrste", tj. hibridiziraju.</s>

<s>Replikacija DNK i transkripcija DNK u  RNK se oslanjaju na hibridizaciju  nukleotida,  pogodnim tehnikama molekularne biologije, uključujući Southern blotove i Northern blotove,  u polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR) u većini pristupa sekvenciranju DNK.</s>

<s>Primjena
Hibridizacije je osnovno svojstvo nukleotidnih sekvenci i ima prednost u brojnim tehnikama molekularne biologije.</s><s>Ukupna genetička srodnost dvije vrste može se odrediti hibridizacijom segmeata njihove DNK (DNK-DNK hibridizacija).</s><s>Ako se pokušavaju hibridizirati  sličnije sekvenca (srodnički usko povezanih organizama), potrebne su više temperature za razdvajanje polulanaca DNK, u odnosu na nesrodnije sekvence.</s><s>Koristi se mnoštvo različitih metoda hibridizacije koje mogu ukazati na porijeklo uzoraka DNK, uključujući i polimeraznu lančanu reakciju (PCR).</s><s>Drugom tehnikom, kratke DNK sekvence su hibridizirane sa  ćelijskom iRNK za identificiranje ekspresije  gena.</s><s>Farmaceutske kompanije istražuju korištenje antisens RNK da se vezuju za neželjene iRNK, sprečavajući ribosome za translaciju iRNK  u protein.</s>

<s>DNK-DNK hibridizacija</s>

<s>DNK–DNK hbridizacija općenito se odnosi na molekularno-genetičku tehniku kojom se mjeri stepen genetičke sličnosti između kompariranih fondova DNK sekvenci.</s><s>Pritom se obično određuje međusobna genetička distanca organizama i/ili populacija.</s><s>Široko se primijenjuje u filogeniji i taksonomiji.</s>

<s>Pincipi
Radioaktivno označena DNK jednog organizma se miješa  miješa s neoznačenom  DNK sa kojom seda se poredi.</s><s>Mješavina se inkubira kako bi se omogućilo da DNK disocira na polulance  i ponovo izduži, te formira hibridni,  dvosttruki (dvolančani)  niz nukleotida  hibridne DNK.</s><s>Hibridizirane sekvence sa visokim stepenom  sličnosti će se povezati čvršće, i zahtijevaju više  energije za  razdvajanje, tj.  one se razdvajaju kada se zagrijavaju na višoj temperaturi nego različitije sekvence.</s><s>To je proces poznat kao "DNK stapanje" (eng. DNK melting).</s><s>Za procjenu profila stopljenje hibridizirane  DNK, dvostruki DNK je potrebno  stavitti u kolonu i smešu grijati  u postupnim malim koracima.</s><s>Na svakom koraku, kolona spere; hibridne sekvence će se u jednom ciklusu spiralizirati i sprati sa  kolone.</s><s>Temperature na kojima označena DNK silazi sa kolone odražavaju  količinu sličnosti između sekvenci (a samohibridizirajući  uzorak služi kao kontrola).</s><s>Ovi rezultati se kombiniraju,  kako bi se utvrdio stupanj genetičke sličnosti između poređenih organizama.</s>

<s>Denaturacija
Denaturacija DNK, također zvana i DNK  stapanje, je proces kojim dvolančana dezoksiribonukleinska kiselina odvija  i razdvaja u jednostruke (polu)niti  kidanjem hidrofobnih veza između baza.</s><s>Oba termina se koriste da se označi  proces jer se javlja kada se mješavina grije, iako se "denaturacija" može odnositi i na odvajanje DNK izazvano hemikalijama kao što je  urea.</s>

<s>Proces DNK denaturacije može se koristiti za analizu nekih njenih  aspekata  DNK,  jer  je uparivanje baza citozin / guanin općenito snažnije od  spajanja para adenin / timin.</s><s>Iznos citozin-guanin u genomu ("GC sadržaj") može se procijeniti mjerenjem temperature na kojoj se genomska DNK stapa.</s><s>Više temperature su znak visokog sadržaja para G-C.</s>

<s>DNK denaturacija se također može koristiti za detekciju razlika između dvije DNK sekvence.</s><s>DNK se zagrijava i denaturira u jednodtruko stanje, a zatim  se hladi kako bi se omogućilo da se niti  hibridiziraju.</s><s>Hibridna molekula se formira između sličnih sekvenci i bilo kakve razlike između tih sekvenci će rezultirati poremećajem uparivanja baza.</s><s>Na genomskoj razini, metod se koristi  za procjenu genetičke udaljenosti  između dvoje vrste, što je proces poznat kao DNK-DNK hibridizacija.</s>

<s>U kontekstu jedne izolirane regije DNK, gradijent denaturacije gelova i temperaturni gradijent gelova se mogu koristiti za otkrivanje prisutnosti malih neusklađenosti između dva niza, što je proces poznat kao temperaturni gradijent gel elektroforeze.</s>

<s>Metode DNK analize  koje su  zasnovana na temperaturi topljenja imaju nedostatak  što za proučavanje služi osnovna sekvencaslijed.</s><s>Uobičajeno je da se sekvenciranje DNK smatra preciznijom  metodom.</s>

<s>Process DNK stapanja se također koristi u tehnikama molekulske biologije, posebno u  lančanoj reakciji polimeraze.</s><s>Iako temperatura stapanja DNK nije  određujuća u ovoj tehnici, metode za procjenu  T m  su važne za određivanje odgovarajuće temperature za primjenu  u određenom protokolu.</s><s>Temperatura DNK  stapanja („meltinga“) može se koristiti i kao prednost za izjednačavanje  hibridizacijskih  strana skupa molekula, npr.  oligonukleotidne  sonde DNK mikronizova.</s><s>Faktori koji utiču na denaturaciju</s>

<s>Izduživanje
Aniling, u genetici, sredstvo za komplementarnost  sekvenci  jednostrukog  DNK  (polulanca) ili RNK uparivanja  spreko  vodikovih veza do formiraju dvostrko usukanih polnukleotida.</s><s>Termin se često koristi za opisivanje vezivanja DNK sonde  ili vezivanje  prajmer na DNK tokom lančane reakcije polimeraze (PCR).</s><s>Pojam se često koristi  i za opisivanje reformacije (renaturalizacije nukleinskih kiselina) komplementarnih niti koje su toplinski denaturirane.</s><s>U  tom procesu mogu pomoći proteini kao što su RAD52.</s>

<s>Primjena u zoologiji 
Kada se nekoliko vrsta komparira na taj način, mjere sličnosti dozvoljavaju da se rekonstruira  filogenetsko stablo.</s><s>Zato je ovo jedan od mogućih pristupa istraživanju molekularne biosistematike.</s><s>Charles Sibley i Jon Ahlquist, pioniri ove tehnike, koristili su  DNK-DNK hibridizaciju da ispitaju filogenetske odnose u  Sibley-Ahlquist taksonomiji ptica i Sibley-Ahlquist taksonomiji  primata.</s>

<s>Primjena u mikrobiologiji
DNK-DNK hibridizacije je zlatni standard za razlikovanje bakterijskih vrsta, kada  vrijednost sličnosti manja od 70%  ukazuje da poređeni sojevi pripadaju posebnim  vrstama.</s>

<s>U 2014. godini,  kao prag sličnosti od 79% je predložen za razdvajanje bakterijskih podvrsta  Escherichia coli ,  kao i prijedlog za razgraničavanje podvrsta ostalih mikroba.</s>

<s>Fluorescentna  in situ hibridizacija
Fluorescentna  in situ hibridizacija (FISH) ije laboratorijski metod koji se upotrebljava za detekciju i lociranje DNK sekvence, često na pojedinom hromosomu.</s>

<s>Istraživači Joseph Gall i Mary Lou Pardue otkrili su u 1960.</s><s>Da se molekulska hibridizacija  može koristiti za identifikaciju DNK sekvenci položaju  in situ (tj. u njihovom prirodnom pozicijama unutar hromosoma).</s><s>U  1969., dva naučnika su objavili rad koji  pokazuje da radioaktivne kopija ribosomske DNK  sekvence može  koristiti za otkrivanje komplementarne DNK sekvence u jezgru žabljeg jajeta.</s><s>Od tih originalnih zapažanja, veoma  su poboljšana i  povećana svestranost i osjetljivost postupka u toj mjeri da  se in situ hibridizacija danas smatra bitnim alatom u citogenetici.</s>

<s>Dvofazni model termodinamike
Za proračun vrijednosti  Tm  primjenjuje se nekoliko formula.</s><s>Za  DNK oligonukleotidee, tj. kratke sekvence  DNK, termodinamika hibridizacije se može tačno odrediti kao dvostepeni proces.</s><s>U ovoj aproksimaciji jedan zanemaruje mogućnost intermedijarnih parcijalnih obavezujuće faza u formiranju stanja dvostruke  niti od dva odvojena uvijena oligonukleotida.</s><s>Prema ovoj pretpostavci,  mogu se elegantno opisati termodinamički parametari za formiranje dvolančane nukleinske kiseline AB iz jednolančanih  nizova  nukleinskih kiselina A i B.
AB ↔ A + B
Ravnotežna konstanta za ovu reakciju je  .</s><s>Suglasno Van´t Hoff ovoj jednadžbi, relacija između slobodne energije,  ΔG i K is ΔG° = -RTln K,  gdje je R  idealni zakon plinske konstante, a  T  je Kelvinska  temperatura reakcije.</s><s>Za sistem nukleinske kiseline, to daje:
.</s>

<s>Temperatura stapanja, Tm, javlja se kada polovina dvostruko lančane  nukleinske kiseline disocira.</s><s>Ako nisu prisutne dodatne nukleinske kiseline, tada će  [A], [B], i  [AB] biti jednake i izjednačene sa inicijalnom koncentracijo  dvolančane nukleinske kiseline [AB]inicijalno.</s><s>To se ispoljava kao stapajuća tačku jednog  dupleksa nukleinske  kiseline: 
.</s>

<s>Jer  ΔG° = ΔH° -TΔS°, Tm je također dat prema:</s>

<s>.</s>

<s>Oznake  ΔH° i  ΔS°  s obično date za asocijaciju a ne disocijacijsku reakciju.</s><s>Ova formula tada prelazi u:</s>

<s>, gdje je [B]ukupno < [A]ukupno.</s>

<s>Kao što je pomenuto, ova jednadžba se temelji na pretpostavci da su u stapljenje uključene samo dvije faze: dvostruka zavojnica slučajna zavojnica.</s><s>Međutim, nukleinska  kiselina se može stopiti i preko nekoliko intermedijarnih faza.</s><s>Za računanje u  takvim slučajevima moraju se koristiti  komplikovane metode statističke mehanone, što je posebno relevantno za duge sekvence.</s>

<s>Procjena termodinamskih svojstava  sekvenci nukleinskih kiselina 
Prethodni podaci  pokazuju kakav je međuodnos temperatura stapanja i termodinamičkih parametara (ΔG ° ili ΔH  ° i Δ S°).</s><s>Posmatranjem temperature stapanja mogu se eksperimentalno odrediti termodinamički  parametari.</s><s>Vice versa, i važni za aplikaciju, kada su poznati termodinamički parametri  date sekvence nukleinske kiseline, može se predvidjeti temperatura stapanja.</s><s>Ispostavilo se da se,  za oligonukleotide, ti parametri mogu dobro aproksimirati modelom  najbližeg susjeda.</s>

<s>Metod najbližeg susjeda (nearest-neighbor metod)
Interakcija između baza na različitim nitima onekle  ovisi osusjednoj  baz.</s><s>Umjesto tretiranja DNK spirale kao niza  interakcija između parova baza, model najbližeg susjeda tretira DNAK spiralu kao niz interakcija između 'susjednih' parova baza.</s><s>Tako, na primjer,  slijedeća DNK   ima najbližeg susjeda interakcije koji je prikazan strelicama.
↓↓↓↓↓ 
  5 C-G-T-T-G-A 3
  3 G-C-A-A-C-T 5
Slobodne energije formiraju  ove DNK iz pojedinačnih niti, ΔG°, predstavljeni su (na 37°C), kao:
ΔG°37(predikcija) = ΔG°37(CG inicijacija) + ΔG°37(CG/GC) + ΔG°37(GT/CA) + ΔG°37(TT/AA) + ΔG°37(TG/AC) + ΔG°37(GA/CT) + ΔG°37(AT inicijacija)</s>

<s>Prvi termin predstavlja energiju prvog baznog para,  CG,  u odsustvu najbližeg susjeda, Drugi termin uključuje obje slobodne energije formacije drugog baznog para, GC, interakcije slaganja između ova bazna para i prethodnog baznog para.</s><s>Preostali termini su definirani na sličan način.</s><s>U principu, slobodne energije formiranja  dvostrukih nukleinskih  kiselina  je:
.</s><s>Svaki  ΔG°  termin ima enhalpični, ΔH°  i entropijski, Δ S°, parametar, tako da promjena slobodne energije također data kao:
 .</s>

<s>Vrijednosti ΔH° i Δ S° su određene za deset mogućih parova interakcije.</s><s>Date su  u  narednoj tabeli, zajedno sa vrijednostima  ΔG° obračunatim  za 37°C. Koristeći ove vrijednosti, vrijednost ΔG37°, za DNK spirale prikazane iznad,  bile su -22.4 kJ/mol.</s><s>Eksperimentalna vrijednost je -21.8 kJ /mol.</s>

<s>Parametri koji su povezani sa deset grupa susjeda  prikazani u u tabeli su određeni iz tački stapanja kratkih oligonukleotidnih  dupleksa.</s><s>Zanimljivo je da ispada  da je nezavisno  samo osam od deset grupa.</s><s>Model najbližeg susjeda može se prodširiti izvan Watson-Crickovih  parova ukljujući parametre za interakcije  između neusklađenosti i susjednih baznih parova.</s>

<s>Ovo proističe iz procjene termodinamičkih parametara sekvenci koje sadrže izolirana neslaganja kao u onim lkoja su pokazana strelicama:
↓↓↓
5' G-G-A-C-T-G-A-C-G 3'
3' C-C-T-G-G-C-T-G-C 5'</s>

<s>Ovi parametri su potvđeni eksperimentima  stapljanja i u  produžetku tabele koji uključuje neusklađenosti koje se mogu naći u literaturi.</s>

<s>Izgleda da je realniji način modeliranja ponašanja nukleinskih kiselina prema imati parametarima koji ovise o susjednim grupama na obje strane jednog nukleotida, dajući podlogu  sa stavke kao što su "TCG / AGC".</s><s>Međutim, to bi značilo postojanje oko 32 grupe; brojni eksperimenati su  potrebni i značajni da se u tom pogledu nađu pouzdani podaci za toliko grupa.</s><s>Zato što se predviđanja metoda najbližeg susjeda razložno slažu s eksperimentalnim rezultatima,  dodatni napori u razvoju drugačijih  modela ne mogu biti opravdani.</s>

<s>Reference</s>

<s>Genetika
Molekulska genetika
Nukleinske kiseline
DNK</s>

