최근 비타민 D가 체내에서 다양한 기능을 수행하는데 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀지고 있다. 체내 비타민 D 수준을평가하는데 현재 면역검사법이 많이 이용되고 있다. 본 연구에서는 4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione (PTAD)를 활용한 Diels-Alder 유도체화와 ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)를 이용하여 25-hydroxyvitamin D3 [25(OH)D3] 및 25-hydroxyvitamin D2 [25(OH)D2]를 동시에 검사하는 방법을 개발하였고, 그 성능을 평가하였다. 혈청에서 비타민 D를 유기용매로 추출하고 50˚C N2에서 1시간 동안 건조시킨 후, 0.1 mg/mL의 PTAD가 포함된 ethyl acetate 를 이용하여 Diels-Alder 유도체화를 시켰다. 이후 methanol-10mM ammonium formate (1:1 V/V) 60 μL에 검체를 재부유시켰다. C18 UPLC 컬럼을 이용하여 분리하였고, 25(OH)D3, m/z 558.35→298.1; 25(OH)D2, m/z 570.35→298.1; hexadeuterated-25(OH)D3,m/z 564.35→298.1의 질량분석기 조건에서 정량하였다. 검사차례내 및 검사차례간 정밀도는 25(OH)D3의 경우 3.5-4.0% 및 3.3-5.5%이었고, 25(OH)D2는 3.8-4.2% 및 4.7-5.8%이었다. 최저정량한계농도는 25(OH)D3 및 25(OH)D2 각각 0.5와 1 ng/mL 이었다. 25(OH)D3는 0-120 ng/mL, 25(OH)D2는 0-90 ng/mL 범위에 걸쳐 모두 직선성이 잘 유지되었다[25(OH)D3, R2 =0.993; 25(OH)D2, R2 =0.998]. 우리나라 성인 집단의 총 25(OH)D의 평균 농도는 18.7 ng/mL로 미국평균 보다는 약간 낮은 분포를 보였고, 10ng/mL 미만의 결핍 비율도 8.1%로 높은 비율을 보였다. PTAD 유도체화와 UPLC-MS/MS를 이용한 25(OH)D3 및25(OH)D2에 대한 본 검사법은 우수한 검사수행능을 보여 임상 검사실에서 비타민 D의 일상적인 검사에 유용하게 사용할 수 있을것으로 기대된다.
본고에서는 4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione (PTAD)를 활용한 Diels-Alder 유도체화와 ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)를 이용하여 25-hydroxyvitamin D3 [25(OH)D3] 및 25-hydroxyvitamin D2 [25(OH)D2]를 동시에 검사하는 방법을 개발하였고, 그 성능을 평가하였다.